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背景:慢性淋巴细胞白血病(Chronic Lymphocytic Leukemia,CLL)是一种好发于老年人的常见惰性B淋巴细胞肿瘤,临床异质性大,目前缺乏特别有效的治疗方法。CLL的发生、发展中有多种信号通路参与,其中NOTCH1信号通路对CLL疾病进展发挥重要作用,NOTCH1突变的CLL更易出现耐药和进展(如Richter综合症),然而其中的分子机制仍有许多不明之处。目的:本研究通过构建ICN(NOTCH1胞内结构域)的过表达质粒和突变质粒,建立ICN未突变和突变的细胞,研究ICN突变后NOTCH1信号转录活性和下游趋化因子CCL17的变化及其调控机制。阐明ICN突变引起CLL侵袭性转化的关键分子,揭示NOTCH1通路中新的核内调控机制,为探索新靶向药物治疗CLL提供研究基础。方法:(1)构建表达ICN野生型质粒和突变型质粒,将质粒电转到Ba F3细胞中,实验分为空载体组、过表达野生组和突变组等三组,采用q RT-PCR、Western Blot验证ICN的m RNA和蛋白表达;将三组质粒转染到293T细胞中,免疫荧光检测三组细胞的NOTCH1蛋白在细胞中的定位情况。(2)构建CSL荧光素酶报告质粒,检测各组细胞NOTCH1的转录活性;进行转录组二代测序,用GO分析和KEGG分析测序数据,q RT-PCR和ELISA检测CCL17、CCL22的表达;Transwell实验检测各组细胞上清诱导胸腺T细胞迁移能力的变化。(3)进行质谱检测并Co-IP验证各组ICN与MTA2/HDAC1的结合情况;GST pull down检测ICN突变体的蛋白结构域是否与MTA2/HDAC1有直接结合作用;Ch IP检测各组细胞MTA2/HDAC1与CCL17启动子的结合变化。结果:(1)构建ICN野生型和突变型质粒,PCR和WB显示ICN野生型和突变型两组细胞的m RNA和蛋白表达水平明显高于空载体组,而且突变型ICN的蛋白分子量比野生型ICN蛋白小;免疫荧光显示野生型组和突变型组的ICN都定位于细胞核;。(2)双荧光素酶报告系统显示野生型组和突变型组的CSL荧光素酶活性高于空载体组,而突变型组的CSL荧光素酶活性高于野生型组;表达谱分析和q RT-PCR显示野生型组和突变型组的CCL17表达高于空载体组,而突变型组的CCL17表达明显高于野生组;ELISA也显示突变型组细胞的CCL17蛋白分泌量明显增多;Transwell实验显示突变型组引起胸腺T细胞迁移数明显高于野生型组。(3)质谱和Co-IP显示野生型组的ICN与MTA2/HDAC1结合,但突变型组中它们的结合明显减弱;GST pull down显示ICN突变部分的蛋白结构域与MTA2/HDAC1有直接结合作用;Ch IP实验显示野生型组MTA2/HDAC1与CCL17启动子结合明显高于空载体组,突变型组MTA2/HDAC1与CCL17启动子结合明显低于野生型组。结论:NOTCH1的活化形式ICN入核后与抑制性转录辅因子MTA2/HDAC1结合,对促进下游基因表达的ICN/CSL/Co A转录激活调控起平衡作用。CLL中ICN突变后产生C端截短的蛋白定位于细胞核内,由于与抑制性转录辅因子MTA2/HDAC1结合的位点缺失,导致其抑制性调控作用减弱,使得NOTCH1通路活性增强并引起CCL17表达上调。CCL17的趋化功能促进胸腺T细胞迁移,增强对CLL细胞免疫调节进而促进肿瘤细胞的增殖。