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研究背景和目的术后疼痛是患者受到手术应激后发生的一种生理、心理及行为等一系列综合反应。据报道大约86%的术后患者有中到重度的术后疼痛的经历。术后疼痛使患者承受了巨大的痛苦并有可能导致一系列器官功能受损,严重者甚至可影响术后康复与生活质量,极大增加了患者和社会的负担。随着人民生活水平的提升,近年来对舒适化医疗的要求越来越高,采用无痛技术消除人民对在医院治疗过程中的疼痛恐惧和困扰成为摆在现实中需要认真对待的问题。术后疼痛管理便是其中值得关注的一个棘手问题。有效的疼痛管理可以加快患者康复,减少住院时间,减轻患者及国家经济负担,提高患者满意度,最终促进医患关系和谐。且与最近几年来提出的加速康复外科(ERAS)理念相符。目前虽然有很多术后镇痛模式在使用,但临床调查研究表明:患者对有效术后急性疼痛治疗的满意度仍低于47%~75%。由此可见,深入探寻急性疼痛的发生发展机制将为寻求针对急性疼痛的特异性治疗靶点和药物开发从而有效控制术后的急性疼痛具有极其重要的意义。目前认为,脊髓的星形胶质细胞和小胶质细胞在因炎症和损伤而产生的疼痛及维持慢性疼痛中发挥重要作用。在大鼠的术后疼痛模型中发现,大鼠切口手术后胶质细胞的活性明显增强,有趣的是文献报道提示小胶质细胞抑制剂米诺环素对于术后痛觉高敏没有作用,因此推测星形胶质细胞可能在急性疼痛中的痛觉高敏中扮演着重要作用。然而星形胶质细胞在术后疼痛发生发展过程中的的细胞和分子水平机制仍不清楚。在中枢神经系统,星形胶质细胞数量占了绝大多数,星形胶质细胞之间通过缝隙连接(gap junction,GJ)紧密结合形成相邻细胞间的通讯通路。GJ的结构和功能已经研究得比较清楚,GJ由分属于两个相对细胞的两个半通道(hemi-channel)组成,而每个半通道由六个同型或异型连接蛋白子(connexins,Cxs)组成,中间形成一个1.5~2.0nm的亲水性通道,这是细胞间进行直接交流的唯一通讯通路,允许细胞间的无机盐离子、糖、氨基酸、维生素、三磷酸腺苷(ATP)、环磷酸腺苷(c AMP)、肌醇三磷酸(IP3)等相对分子质量小于1ku的分子通过。每个连接蛋白子根据他们的分子量命名,目前在哺乳动物发现有超过21个连接子亚型,星形胶质细胞最主要而且最显著的连接蛋白子是Cx43。在神经性痛的情况下,包括慢性收缩性坐骨神经痛,完全氟氏佐剂和部分坐骨神经结扎引起的疼痛,脊髓中星形胶质细胞Cx43明显增加;阻断脊髓星形胶质细胞缝隙连接或Cx43基因敲除可以减少周围神经损伤引起的背角中枢敏化。重要的是,Cx43的表达是否在急性疼痛也相应改变以及星形胶质细胞Cx43组成的GJ或者半通道缝隙连接机制是否参与了急性切口痛的发生需要进一步阐明。参考Schuwaller等建立的足底后爪切口术后疼痛模型,在本实验测定了星形胶质细胞特异性缝隙连接蛋白Cx43以及神经元和少突胶质细胞特异性缝隙链接蛋白在急性切口痛模型中的变化;此外,本实验还研究了缝隙连接抑制剂甘珀酸(carbenoxolone,CBX)以及半通道抑制剂INI-0602对大鼠脊髓星形胶质细胞活化和机械性痛阈的影响,以此观察脊髓星形胶质细胞Cx43在急性术后切口痛中的作用。实验方法1.选用雄性S-D大鼠(200-220g),分4组,对照组,手术+NS组,手术+CBX处理组和手术+INI-0602处理组。根据Schuwaller等人的方法建立大鼠左足底急性切口痛模型。椎管内给药方法按照Hylden与Wilcox描述的方法进行。2.通过von Frey触觉测量器测量记录实验大鼠的缩足阈值(paw withdrawal threshold,PWT),测量大鼠对机械刺激的敏感性;通过聚焦辐射热源对准老鼠的后肢足底外侧部位玻璃进行热痛阈测定,记录老鼠的缩足潜伏期(paw withdrawal latency time,PWL),测量大鼠对热刺激的敏感性。用Western Blot方法检测大鼠左侧脊髓L4-L5节段缝隙连接Cx32、Cx36、Cx43以及星形胶质细胞特异性标志蛋白GFAP的表达情况。3.用免疫荧光的方法检测大鼠左侧脊髓L4-L5节段星形胶质细胞特异性蛋白GFAP和Cx43的表达情况。实验结果1.急性切口痛模型组大鼠脊髓背角星形胶质细胞活性增加,GFAP表达增加GFAP是星形胶质细胞特异性蛋白,它的表达增减可以认为与星形胶质细胞的活性密切相关。Western Blot显示本实验急性切口痛模型组相对于正常对照组脊髓背角星形胶质细胞GFAP在术后30分钟可以看到增加,两小时达峰值,24小时后恢复至正常对照组水平。免疫荧光同样显示两小时后同侧脊髓节段的GFAP增加。2.急性切口痛模型组大鼠脊髓背角星形胶质细胞缝隙连接Cx43表达增加,而代表神经元缝隙连接Cx36和少突胶质细胞缝隙连接Cx32表达无变化星形胶质细胞主要表达Cx43,神经元细胞主要表达Cx36,少突胶质细胞主要表达Cx32。我们的研究结果发现:Cx43在切口痛大鼠同侧脊髓背角的表达明显增加,我们同时检测了脊髓背角Cx32和Cx36的表达。结果显示急性切口痛组与正常对照组相比,Cx32和Cx36的蛋白表达无统计学意义。这些结果提示星形胶质细胞Cx43在急性切口痛模型中扮演着重要作用。3.缝隙连接通道抑制剂或半通道抑制剂能减少急性切口痛模型组大鼠手术后疼痛反应星形胶质细胞Cx43在急性疼痛组模型中表达增加,提示Cx43在其中起重要作用,而Cx43可以通过缝隙连接通路(GJ)或半通路(hemichannel)两种方式起作用。实验表明,急性切口痛模型大鼠在术后30min开始出现明显的机械痛和热痛敏,2h达高峰,4h开始下降。鞘内应用缝隙连接抑制剂甘珀酸(CBX)可以减轻大鼠急性切口痛模型同侧的机械痛和热痛的反应,而对对侧后肢的机械痛阈与热痛阈没有影响;鞘内应半通道抑制剂INII-0602也明显减轻大鼠急性切口痛模型同侧的机械痛和热痛的反应,而对对侧后肢的机械痛阈与热痛阈没有影响。4.缝隙连接通道抑制剂和半通道抑制剂抑制脊髓背角星形胶质细胞GFAP的表达Westernblot也显示急性切口痛大鼠术后2小时GFAP表达明显增加,12小时后GFAP表达和对照组相比无差异。术前鞘内注射缝隙连接通道抑制剂和半通道抑制剂可以降低术后2小时GFAP的表达。免疫荧光显示:相对于正常对照组,急性切口痛手术组术后2小时GFAP明显增加,而术前鞘内注射缝隙连接抑制剂CBX或半通道抑制剂INI-0602能明显减少术后2h脊髓背角星形胶质细胞GFAP表达的增加。结论:脊髓背角星形胶质细胞缝隙连接Cx43在急性切口痛的产生中发挥作用。