黄曲霉毒素（aflatoxin）主要由黄曲霉和寄生曲霉产生,目前已发现20多种,具有极强的毒性和致癌性,易污染玉米、花生、调味品等农产品及其制品,严重危害农产品及食品质量安全,威胁消费者健康,给我国农业经济带来巨大经济损失。建立黄曲霉毒素的快速检测方法是防止其造成食品安全问题的重要手段。免疫分析法具有操作简单、灵敏快速、不受场所影响等优点,适合黄曲霉毒素的现场高通量筛检。黄曲霉毒素是小分子化合物,一般采用竞争免疫分析模式进行检测,通过抗原和游离毒素竞争结合抗体进行定量分析。黄曲霉毒素抗原的合成需要大量毒素标准品,不仅价格昂贵,而且会对实验人员及环境带来较大危害。因此,开发安全高效的黄曲霉毒素抗原替代物,并建立相应的免疫分析方法具有重要的意义。本研究以抗独特型纳米抗体VHH2-5作为替代抗原,构建抗独特型纳米抗体-碱性磷酸酶融合蛋白,以抗坏血酸磷酸酯镁为碱性磷酸酶的反应底物,牛血清白蛋白稳定的金纳米簇（Bovine Serum Albumin-stabilized Gold Nanoclusters,BSA-Au NCs）催化TMB氧化的反应作为比色和荧光分析法的信号输出源,建立了双信号酶联免疫分析法（Dual-signal Enzyme Immunoassay,ds-ELISA）快速检测黄曲霉毒素。主要研究内容如下:（1）构建抗独特型纳米抗体-碱性磷酸酶融合表达载体在前期研究基础上,以黄曲霉毒素抗独特型纳米抗体VHH2-5为研究对象,将VHH2-5基因和碱性磷酸酶基因克隆至原核表达载体p ET-25b中,构建抗独特型纳米抗体-碱性磷酸酶融合表达载体p ET-AP-VHH2-5,将表达载体转化到大肠杆菌E.coli BL21（DE3）中建立融合蛋白原核表达体系,经过IPTG诱导表达与镍柱纯化成功得到抗独特型纳米抗体-碱性磷酸酶融合蛋白AP-VHH2-5,经验证,该融合蛋白具有抗体识别活性和碱性磷酸酶活性。（2）建立黄曲霉毒素双信号输出酶联免疫分析法合成牛血清白蛋白稳定的金纳米簇BSA-Au NCs,对BSA-Au NCs的紫外吸收光谱、荧光光谱和粒径等进行表征,合成的BSA-Au NCs发出红色的荧光,粒径为2 nm,具有过氧化物酶催化活性。基于抗独特型纳米抗体-碱性磷酸酶融合蛋白和BSA-Au NCs建立了黄曲霉毒素双信号输出酶联免疫分析法。其中,酶联免疫比色分析法检测灵敏度IC50为0.54 ng/m L,线性范围为0.16-1.80 ng/m L;酶联免疫荧光分析法检测灵敏度IC50为0.67 ng/m L,线性范围为0.37-1.22 ng/m L。该方法可同时检测黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1,与伏马菌素B1（FB1）,赭曲霉毒素A（OTA）,玉米赤霉烯酮（ZEN）,呕吐毒素（DON）等真菌毒素未见交叉反应。对四川花椒、大米、玉米三种空白样品添加不同浓度的AFB1,样品检测回收率在81%-119.5%之间。