瓜类细菌性果斑病菌(Acidovorax citrulli,Ac)是一种种传病菌,可感染西瓜、甜瓜、哈密瓜、南瓜、黄瓜、丝瓜等多种葫芦科植物,导致减产甚至绝收。该病菌的抗逆能力非常强,可在种子表面存活35年,并通过带菌种子实现远距离传播。Ac可侵染果实、植株及种子,具有发病迅速、爆发性强、传播快等特点,一旦感染会对瓜类产量带来巨大经济损失,该病害是影响我国瓜类生产的主要病害之一。目前,检测果斑病菌常用的方法为基于PCR的方法,该方法检测灵敏度相对较高,但需要精密的热循环仪,且需要3~4 h才能获得比较准确的结果。此方法需要在一个装备齐全的实验室中进行,不适用于病原菌的田间快速检测。免疫学检测方法,如酶联免疫吸附测定法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)需要较长的孵育时间,不适用于田间快速检测。而免疫学快速检测方法,如免疫层析试纸条,其操作简便、检测时间短,不需要使用仪器,在田间病原菌的快速筛查上具有良好的应用前景。为建立检测果斑病菌的免疫学快速检测方法,本课题首先制备了抗瓜类细菌性果斑病菌SD01的单克隆抗体,结果显示:以果斑病菌野生型菌株SD01免疫BALB/c小鼠,采用细胞融合技术,选择性培养基及间接ELISA法筛选,成功获得4株分泌抗菌株SD01抗体的单克隆杂交瘤细胞,抗体亚型均为IgG 2a。经制备小鼠腹水并纯化后得到4种单克隆抗体,命名为:6F,6D,7E,4F。间接ELISA法检测4种抗体(2 mg/mL)的效价分别可达到1:12800、1:6400、1:3200、1:6400,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳验证纯化的4种抗体均有一条约25 kD的轻链,一条约50 kD的重链,无多余的杂带,抗体纯化效果较好。间接ELISA法检测4种抗体对8株果斑病菌及6株近源的植物病原菌的结合情况,发现6D及4F可以结合8株果斑病菌;6F可以结合6株果斑病菌,与00-1、tw31不结合;7E可以结合5株果斑病菌,与ATCC 29625、00-1、tw31不能结合;6D及7E与6株近源的植物菌均无交叉反应,6F与NCPPB 961、ATCC 33996存在交叉反应;4F与ATCC 33996、ATCC 19307存在交叉反应。通过HRP酶标记6D及4F成功研制了双抗体夹心ELISA法,用于检测果斑病菌SD01的检测灵敏度为10~5 CFU/mL,研究结果表明,本实验成功制备了一株特异性较强的单克隆抗体6D,其次为4F,可用于建立免疫学快速检测方法。由于单抗6F及7E存在与其它果斑病菌不结合的情况,在制备免疫快速检测方法上并不适用。为进一步验证制备的单克隆抗体在实际应用时的检测性能,本课题选取胶体金纳米粒子作为示踪标记物,选取单克隆抗体6D用于胶体金标记后固定在试纸条的结合垫上,同时选取单抗6D及羊抗鼠IgG抗体分别喷涂于硝酸纤维素膜(NC膜)的检测线区域及质控线区域,研制抗体自配对型的胶体金免疫层析试纸条,并对试纸条的灵敏度、特异性、稳定性进行评估。对分别携带8株果斑病菌的西瓜植株样品进行模拟带菌检测,并采用PCR法验证试纸条检测实际样品结果的准确性。研究结果表明,抗体自配对的胶体金免疫层析试纸条特异性良好,可检测8株果斑病菌,与6株近源的植物病原菌无交叉反应;对纯培养细菌的检测灵敏度为10~5CFU/mL;试纸条可以在室温条件下储存至少6个月而不失去检测的稳定性;对分别携带8株果斑病菌(浓度为10~5 CFU/mL)的西瓜植株样品均检出为阳性;常规PCR法对实际样品的验证结果与试纸条检测结果一致,表明研制的抗体自配对型的胶体金试纸条可用于田间样品的快速检测。目前,基于抗体自配对的免疫层析试纸条在国内外尚未见报道,抗体自配对的方法为双抗体夹心模式的一种扩展,仅使用一种抗体研制双抗体夹心模式的免疫层析试纸条的成功应用,进一步表明该应用模式可以延伸到其它免疫学检测方法的研制上,并成为特异性强的单抗难以获得时研制免疫学检测方法的一种新的构建方式及补充。胶体金作为示踪标记物是目前免疫层析分析技术中最常用的有色标记物,为进一步简化制备免疫层析试纸条的程序并节省成本,本课题进一步研制了一种新型的基于抗原标记的荧光免疫层析试纸条。在本研究中,使用异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate,FITC)作为示踪标记物,将其添加到细菌培养基中对培养基进行改良。细菌通过改良的培养基培养后可以发出稳定的黄绿色荧光,使其在培养过程中成为一种荧光探针。荧光免疫试纸条的成功研制基于荧光细菌与固定在检测线上未标记的单抗6D结合而实现,本方法研制的荧光试纸条仅需要一株未标记的抗体,简化了试纸条的制备程序并省去标记抗体的使用从而节约了成本。对试纸条的灵敏度、稳定性、特异性进行评估,并对田间采集的13种西瓜植株样品、13种西瓜种子样品及6种西瓜病变样品进行检测,同时用常规PCR法对试纸条检测结果的准确性进行验证。结果表明,试纸条的检测灵敏度为10~6 CFU/mL,检测结果可在15分钟内观察;试纸条可以检测8株果斑病菌,且与其它30株病原菌无交叉反应;试纸条可以在室温条件下储存至少4个月;对实际样品的检测结果与使用常规PCR法的结果一致,表明荧光试纸条在检测实际样品时具有较高的准确性。本研究实现了示踪标记物从标记抗体到标记抗原的转移,研制的基于抗原标记的荧光试纸条,由于仅需要一种无标记的抗体,成功摆脱了传统的抗体标记式的双抗体夹心模式,从而降低了成本,使荧光试纸条更容易推广应用及普及化。为提高制备的荧光免疫层析试纸条的检测灵敏度,本课题进一步使用FITC标记单抗4F,并喷涂于试纸条的结合垫上成为捕捉抗体,同时使用改良的培养基培养细菌,成功研制出了基于信号放大系统的抗原-抗体双标记的荧光试纸条。在本次研究中,荧光细菌作为第一个荧光探针,FITC标记的单抗4F作为第二个荧光探针,质控线和检测线的获得是通过将羊抗鼠IgG抗体及抗果斑病菌的单克隆抗体6D分别喷涂在NC膜的两端。对试纸条的灵敏度,稳定性,特异性进行评估,并分别对携带8种果斑病菌的西瓜样品进行检测。结果表明,试纸条可以检出8种果斑病菌,与其它6株近源的植物病原菌无交叉反应;肉眼可观察到的最低检出限为10~5 CFU/mL,与使用FITC仅标记抗原或仅标记抗体的荧光免疫层析试纸条相比,灵敏度提高了10倍;可在室温条件下储存至少4个月;试纸条对模拟带菌样品的检测结果与PCR的检测结果一致,表明研制的双标记的荧光免疫层析试纸条可用于实际样品的快速检测。本研究通过使用FITC标记抗原及抗体,成功研制了基于信号放大系统的双标记荧光免疫层析试纸条,成功实现了信号放大,检测灵敏度可提高10倍。本研究在制备了抗果斑病菌的特异性较强的单克隆抗体的基础上,选取有色标记物中胶体金纳米粒子、发光标记材料中的FITC用于研制免疫层析试纸条的示踪标记物。在胶体金标记单抗6D的基础上,成功研制了抗体自配对型的免疫层析试纸条;以FITC标记细菌为基础,成功研制了以标记抗原为基础的荧光免疫层析试纸条;以FITC标记细菌及单抗4F为基础,研制了基于抗原-抗体双标记的免疫层析试纸条。并分别评价了三种试纸条的灵敏度,特异性,稳定性及对实际样品的检测性能。研制的三种免疫层析试纸条与传统的ELISA法及常规PCR方法相比,缩短了检测时间并简化了操作步骤,这种简单,低成本且易于推广的方法将在植物病原菌的监测中起重要作用。