糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)作为终末期肾病的主要原因,是糖尿病的常见并发症之一。近年来,研究证据表明核转录因子Kappa B(nuclear factor kappa B,NF-κB)的激活和含有热蛋白结构域的甘氨酸结合及寡聚结构域样受体3炎症因子(NACHT,LRR and PYD domain-containing protein 3,NLRP3炎症小体)在糖尿病肾病的炎症进展过程密切相关。然而,它们的机体作用机制尚不清楚。近年来研究显示,长链非编码RNA(long non-coding RNA,lnc RNA)异常表达在糖尿病肾病等多种疾病中扮演着重要角色。然而,lnc RNA在糖尿病肾病的炎症过程中的功能和作用机制仍未揭开神秘面纱。在我们课题组前期实验中,我们通过转录组测序技术(RNA sequencing,RNA-seq)和实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR,q RT-PCR)在糖尿病肾病db/db小鼠肾脏组织中鉴别了14个呈异常表达的lnc RNAs。在目前的实验中,我们进一步通过q RT-PCR检测这14个糖尿病肾病相关的lnc RNAs在高、低糖条件下培养的系膜细胞中的表达情况,实验结果显示其中12个lnc RNA在肾脏组织和系膜细胞中的表达趋势一致。我们通过生物信息学预测进一步发现在这12个异常表达的lnc RNAs中,只有上调差异倍数最大的基因间长链非编码RNA Gm4419与糖尿病肾病炎症相关的NF-κB亚基p65和p50存在潜在的结合位点点。此外,沉默Gm4419能够明显抑制高糖条件下培养的系膜细胞促炎症因子、肾脏纤维标记蛋白的表达和细胞增殖。然而过表达Gm4419能够促进低糖条件下培养的系膜细胞的系膜细胞的促炎症因子、肾脏纤维标记蛋白的表达和细胞增殖。更有趣的是,Gm4419通过直接与NF-κB的亚基p50相互作用激活NF-κB通路。另外,我们发现在系膜细胞中p50能直接作用于NLRP3炎症小体。因此,我们用以下实验展示,linc RNA Gm4419可能通过NF-κB/NLRP3炎症小体信号通路参与高糖条件下培养的系膜细胞炎症、纤维化和增殖,这可能为Gm4419在糖尿病肾病的进展过程中的调控机制提供新视角。第一部分Gm4419在小鼠肾小球系膜细胞中的表达、分布及对系膜细胞炎症、纤维化和增殖的影响目的检测高、低糖培养的小鼠肾小球系膜细胞中Gm4419的表达、分布以及Gm4419对高、低糖培养的系膜细胞炎症、纤维化和增殖的影响,初步探讨Gm4419与糖尿病肾病的关系。方法通过q RT-PCR检测14个糖尿病肾病相关的lnc RNAs在高、低糖条件下培养的系膜细胞中的表达情况,并从中选取上调差异倍数最大,且生物信息学预测唯一与糖尿病肾病炎症相关的NF-κB有绑定位点的lnc RNA Gm4419为研究对象。FISH和q RT-PCR检测Gm4419在系膜细胞中的定位;构建pc DNA3.1(+)-Gm4419过表达质粒,同时设计合成Gm4419 si RNA,并将pc DNA3.1(+)-Gm4419过表达质粒和Gm4419 si RNA分别转染至低、高糖培养的肾小球系膜细胞,q RT-PCR检测促炎症因子和肾脏纤维标记蛋白的m RNA表达水平;western blot和免疫荧光检测促炎症因子和肾脏纤维标记蛋白的蛋白表达水平情况;Ed U法和流式细胞术检测转染后细胞的增殖能力。结果Gm4419在高糖培养的肾小球系膜细胞中的表达水平较L-MC组显著增高(p<0.01)。将酶切和测序结果证实构建成功的pc DNA3.1(+)-Gm4419过表达质粒转染至L-MC组细胞,与L-MC mock组或L-MC pc DNA3.1组相比,L-MC Gm4419(+)组细胞炎症因子、纤维化标记蛋白表达水平增高以及增殖能力增强((p<0.05)。此外,q RT-PCR筛选出一条最佳干扰Gm4419的小干扰RNA(small interfering RNA,si RNA),转染H-MC组后,与H-MC mock组或H-MC si NC比较,H-MC Gm4419 si RNA组细胞炎症因子、纤维化标记蛋白表达水平增高以及增殖能力减少(p<0.05)。结论lnc RNA-Gm4419参与糖尿病肾病小鼠肾小球系膜炎症、增生和纤维化的调节。第二部分Gm4419通过NF-κB/NLRP3炎症小体信号通路调控肾小球系膜细胞中促炎症因子的表达目的探讨调节Gm4419的表达对NF-κB/NLRP3炎症小体信号途径激活的调控及对下游促炎症因子、纤维标记蛋白和系膜细胞增殖的影响。方法通过q RT-PCR检测小鼠肾小球系膜细胞在低糖条件下转染Gm4419过表达质粒对NF-κB亚基p50和p65的m RNA相对表达水平的影响;通过q RT-PCR检测小鼠肾小球系膜细胞在高糖条件下转染Gm4419 si RNA对NF-κB亚基p50和p65的m RNA相对表达水平的影响;通过western blot检测小鼠系膜细胞在低糖条件下转染Gm4419过表达质粒对NF-κB转录因子关键蛋白p-IκBα、IκBα、p50和p65相对表达水平的影响;通过western blot检测小鼠系膜细胞在高糖条件下转染Gm4419 si RNA对NF-κB转录因子关键蛋白p-IκB、IκB、p50和p65相对表达水平的影响;细胞免疫荧光化学定位小鼠系膜细胞中转染Gm4419过表达质粒和Gm4419 si RNA对p50和p65进入细胞核情况的影响;通过Ch IP检测调节Gm4419的表达对NF-κB转录因子与Gm4419和NLRP3炎症小体启动子结合以及转录的影响;通过q RT-PCR和FISH检测调节p50的表达对细胞核和细胞质中Gm4419表达的影响;通过q RT-PCR、western blot、细胞免疫荧光化学和FISH检测同时过表达或同时沉默Gm4419和p50对Gm4419和p50的m RNA水平以及p50的蛋白水平的影响;通过q RT-PCR检测过表达Gm4419或p50对NLRP3炎症小体m RNA表达的影响;通过q RT-PCR检测沉默Gm4419或p50对NLRP3炎症小体m RNA表达的影响;通过western blot和细胞免疫荧光化学检测调节Gm4419或p50的表达对NLRP3炎症小体蛋白表达的影响;通过免疫沉淀检测p50抗体能否沉淀内源性NLRP3炎症小体蛋白;通过细胞免疫荧光化学检测p50与内源性NLRP3炎症小体之间的共定位情况;通过western blot检测SN50特异性阻断p50或(和)JSH-23特异性阻断p65的活性后,调节Gm4419的表达对NLRP3炎症小体及下游炎症因子的蛋白表达的影响;通过western blot检测在过表达Gm4419,并同时阻断p65的活性后Gm4419对NLRP3炎症小体及下游炎症因子的蛋白表达的影响。结果QRT-PCR结果显示,过表达Gm4419可以促进p50和p65 m RNA表达(p<0.01),而沉默Gm4419可以抑制p50和p65 m RNA表达(p<0.01);western blot结果显示,过表达Gm4419可以促进IκB磷酸化形成p-IκB并降解从而引起细胞核内p50和p65相对表达水平明显升高(p<0.01),而沉默Gm4419可以抑制IκB磷酸化形成p-IκB并降解从而引起细胞核内p50和p65相对表达水平明显降低(p<0.01);细胞免疫荧光化学显示,过表达Gm4419可以促进p50和p65蛋白向细胞内转移,而沉默Gm4419可以抑制p50和p65蛋白向细胞内转移;Ch IP检测结果发现过表达Gm4419可以促进p50而非p65蛋白与Gm4419和NLRP3炎症小体启动子结合并促进它们转录(p<0.01),而沉默Gm4419可以抑制p50而非p65蛋白与Gm4419和NLRP3炎症小体启动子结合并抑制它们转录(p<0.01);q RT-PCR和FISH结果显示,过表达p50可以促进细胞核和细胞质内Gm4419表达,而沉默p50可以抑制细胞核和细胞质内Gm4419表达;q RT-PCR、western blot细胞免疫荧光化学和FISH结果显示,同时过表达Gm4419和p50可以促进Gm4419和p50的m RNA水平以及p50的蛋白水平显著升高,而沉默Gm4419和p50可以抑制Gm4419和p50的m RNA水平以及p50的蛋白水平显著降低;q RT-PCR结果显示,过表达Gm4419或p50可以促进NLRP3炎症小体m RNA表达,而沉默Gm4419或p50可以抑制NLRP3炎症小体m RNA表达;western blot和细胞免疫荧光化学结果显示,过表达Gm4419或p50可以促进NLRP3炎症小体蛋白表达,而沉默Gm4419或p50可以抑制NLRP3炎症小体蛋白表达;免疫沉淀结果显示,p50抗体能够沉淀内源性NLRP3炎症小体;细胞免疫荧光化学显示p50与内源性NLRP3炎症小体在系膜细胞中存在共定位现象;western blot结果显示,在低糖培养的系膜细胞中过表达Gm4419,加入p50的特异性活性阻断剂SN50或同时加入SN50和p65的特异性活性阻断剂JSH-23,Gm4419对NLRP3炎症小体及下游炎症因子的蛋白表达没有影响;而在低糖培养的系膜细胞中过表达Gm4419,并只加入JSH-23后Gm4419对NLRP3炎症小体及下游炎症因子的蛋白表达仍然有显著影响。结论Gm4419可能通过NF-κB/NLRP3炎症小体信号通路参与高糖条件下培养的系膜细胞炎症、纤维化和增殖。