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1.背景及目的心肌梗死（myocardial infarction,MI）后约有25%的人群发展为心力衰竭（heart failure,HF）。虽然目前的治疗方法已经大大降低了HF的死亡率,但HF的5年生存率仍然接近50%。研究表明,MI后过度的炎症反应在心肌重塑和HF的发生发展中起重要作用。及时地控制MI后的炎症反应,是延缓或阻断MI后HF的新策略。然而,目前并没有抗炎药用于MI后HF的防治。黄芪临床常用于心血管疾病的治疗,具有广泛的药理活性,包括抗炎效应。其主要有效成分为黄芪甲苷。黄芪甲苷成药性差,生物利用度低,经过结构改造后的衍生物HHQ16水溶性好,利于后续新药研发。本实验目的是研究HHQ16对MI后心功能的保护作用及抗炎机制,旨在为MI后炎症的控制及HF防治相关药物的开发提供候选药物和潜在靶点。2.方法体内利用左前降支（Left anterior descending branch,LAD）结扎构建MI模型,采用灌胃的方式评价HHQ16的心功能保护和抗炎作用;以超声心动图来检测心功能的变化;用苏木精-伊红染色法（HE染色）评估HHQ16对心肌组织病理的影响,同时TTC染色评价HHQ16对梗死面积的影响;以RT-PCR观察HHQ16对组织炎症的影响;采用免疫组化检测HHQ16对T、B、NK、巨噬细胞等免疫细胞对心肌组织浸润的影响;采用流式细胞技术定量评估HHQ16对免疫细胞群数量及比例的影响;体外构建LPS诱导RAW264.7细胞炎症模型,采用CCK8法判断HHQ16对RAW264.7细胞有无毒性;采用ELISA法测定HHQ16对NO含量的影响,以期找到HHQ16抗炎的最佳浓度;采用RT-PCR、免疫印迹法（Western Blot）检测HHQ16对炎症因子的影响;采用Western Blot法判断HHQ16的可能抗炎作用机制。3.结果3.1构建心肌梗死模型6-8周C57雄性小鼠适应性喂养一周后,利用LAD结扎构建MI模型,分别在4 h后用心电图和24 h后用超声心动图检测小鼠心功能变化,结果显示小鼠ST段抬高,左室射血分数（left ventricular ejection fraction,LVEF）、短轴缩短率（short axis shortening rate,LVFS）等心功能指标均明显下降,说明造模成功。3.2 HHQ16（10 mg/kg）显著改善MI小鼠的心功能,减轻病理损伤,降低梗死面积（1）HHQ16可显著升高心肌梗死小鼠LVEF、LVFS等。6-8周C57雄性小鼠分为假手术组,模型组,HHQ16组。模型组,HHQ16组（10 mg/kg）于构建MI模型24 h后,分别灌胃给药3天、7天、14天,超声心动图检测小鼠心功能的变化,其中模型组给予羧甲基纤维素钠（Carboxymethylcellulose sodium）;HHQ16组给予10 mg/kg的HHQ16。结果表明:HHQ16可以显著升高LVEF、LVFS等心功能指标。（2）HHQ16（10 mg/kg）改善心肌组织损伤取MI后3、7、14天三个时间点的假手术小鼠,模型组小鼠和HHQ16组小鼠心脏进行HE染色。结果显示:假手术组在MI后3、7、14天心肌细胞均排列整齐,无明显病变。而模型组在MI后3天时炎细胞浸润显著增加,红细胞外渗,相比于模型组,HHQ16在MI后3天时减轻炎细胞浸润,减轻出血症状;模型组在MI后7天时,心肌横纹模糊甚至消失,炎细胞浸润增加,而HHQ16减轻炎细胞浸润,减轻心肌紊乱程度;模型组在MI后14天时,红细胞外渗显著增加,间质水肿,小血管增生,HHQ16治疗后出血减少,细胞排列整齐。（3）HHQ16（10 mg/kg）降低小鼠梗死面积取MI后14天的假手术小鼠,模型组小鼠和HHQ16组小鼠心脏进行TTC染色,并统计梗死率。结果显示:HHQ16可以显著降低梗死面积。3.3 HHQ16（10 mg/kg）显著降低心肌组织炎症因子表达。免疫组化和流式检测表明,HHQ16主要抑制巨噬细胞浸润,对T、B和中性粒细胞浸润无明显影响。（1）HHQ16显著降低心肌组织炎症因子表达取MI后3、7、14天的各组小鼠心脏检测IL-1β、IL-6、TNF-α的表达。结果显示:HHQ16可以显著降低IL-1β、IL-6、TNF-α的m RNA表达。（2）HHQ16抑制巨噬细胞的浸润取MI后3、7、14天的假手术小鼠,模型组小鼠和HHQ16组小鼠心脏进行免疫组化实验,确定HHQ16影响的具体免疫细胞群（T细胞、B细胞、巨噬细胞、中性粒细胞）。结果显示HHQ16在MI后3天显著降低巨噬细胞浸润;MI后7天、14天HHQ16对巨噬细胞浸润无明显影响。同时MI后3天、7天、14天HHQ16对T细胞、B细胞、中性粒细胞的浸润均无明显影响。取MI后1、3、7天的假手术小鼠,模型组小鼠和HHQ16组小鼠心脏进行组织流式实验。结果显示MI后1、3天HHQ16均能显著抑制巨噬细胞浸润,而MI后1、3、7天HHQ16对T细胞、B细胞、中性粒细胞的浸润均无明显影响。3.4 HHQ16可能通过抑制MKK4/Jnk/NF-κB通路抑制炎症（1）HHQ16在浓度为1 n M-100μM时对Raw264.7细胞无明显毒性HHQ16分别作用于RAW264.7细胞12 h、24 h,检测细胞活力变化。结果显示:HHQ16从10 n M-100μM对RAW264.7细胞均无明显毒性。（2）HHQ16在10μM给药剂量时降低一氧化氮（Nitric Oxide,NO）的含量梯度浓度的HHQ16作用于RAW264.7细胞12 h后,利用脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）构建RAW264.7炎症模型,24 h后取细胞培养液上清检测NO的含量。结果显示:HHQ16在10μM的给药剂量下降低NO的含量。（3）HHQ16在10μM时降低LPS模型上炎症因子的表达同样梯度浓度的HHQ16作用于RAW264.7细胞,然后利用LPS构建RAW264.7炎症模型,检测炎症因子的表达。结果显示:HHQ16在10μM时可以显著降低IL-1β、IL-6的m RNA和蛋白的表达,对TNF-α的表达无明显影响。（4）HHQ16显著降低CCL2/CCR2的表达在RAW264.7细胞炎症模型上,HHQ16可显著降低LPS诱导的趋化因子CCL2及其受体CCR2的高表达。（5）HHQ16显著降低靶标MKK4的表达前期研究发现HHQ可以直接结合MKK4。我们发现,HHQ16可显著降低LPS诱导的MKK4的表达及其磷酸化,其下游Jnk和NF-κB活化均被抑制。4.结论1、HHQ16显著抑制心肌组织巨噬细胞浸润和炎症因子水平,保护MI后心功能。2、抗炎作用与抑制MKK4及其下游Jnk/NF-κB通路活化有关。