野菊花为菊科植物野菊Chrysanthemum indicum L.的干燥头状花序,秋、冬二季花初开放时采摘,晒干或蒸后晒干。具有清热解毒,泻火平肝之功效;用于疔疮痈肿,目赤肿痛,头痛眩晕等症。野菊花用途广泛,在药品、保健品、日化产品等行业及临床上、民间得到广泛应用。野菊野生资源广泛分布于我国东北、华北、华中、华南、华东和西南等地,多生于山坡、草地、田边和路旁等处。目前,市场上野菊花药材以野生资源为主。随着市场对野菊花的需求量逐年增加,对野生资源的采收量随之上升,农民乱采乱伐,使野菊再生资源遭到破坏,野菊的生长面积逐年缩小,其野菊花的资源量也随之减少。野生野菊由于内在遗传和生长环境差异性,致使野菊花药材品质差异较大,常有蒙花苷含量不符合药典规定及掺杂现象。中药材天地网统计表明野菊花价格近5年涨幅为325%,已上涨至68元/kg。因而,进行野菊的资源研究和野菊花药材品质评价工作具有重大意义。本课题综合运用药用植物学、药用植物资源学、药用植物生态学知识,结合现代分析技术和分子生物学手段,对野菊及野菊花药材进行资源调查、样品收集、种质资源圃建立、化学成分分析、遗传多样性鉴定分析、种质差异评价等研究,以基础研究与应用研究互相渗透融合,着眼于野菊资源保护与产业发展相结合,为野菊种质资源保护与开发、野菊良种选育、野菊花质量标准完善和提高提供科学依据,主要研究结果如下:一、野菊资源调查研究对我国安徽、湖北、河南、陕西、山西、广东、广西7省50县/市的野菊进行资源调查。结果表明,野菊生长环境各异,适应性强,分布广泛,在东经E107.54°~E118.10°,北纬N23.18°~N35.16°,海拔18m~1083m均有生长,以大别山、秦岭、中条山、伏牛山、太行山等山区与平原的交接地带为多,以平原地区为少。目前野菊花药材主要来源于野生,规范化种植基地仅华润三九医药股份有限公司在湖北省阳新县建设的野菊花GAP基地。野生野菊的现有调查区域,测算野菊花蕴藏量为5441.4吨,但受人工、采摘习惯及有些人无法企及的地域等影响,以致实际可采收量远低于其蕴藏量,加之大部分区域野菊花中蒙花苷含量达不到药典规定,而无法作为药材供应,目前已经远远不能满足社会需求。二、野菊种质收集在资源调查基础上,结合野菊植株形态差异,挑选出32个具有代表性野菊种质,进行野菊植株活体异地迁移,于湖北省阳新县建立野菊种质资源圃,搭建自然研究平台,为野菊种质保存、种质差异分析比较、优良种质选育、以及后续优良种质杂交及申报新品种等工作提供实验素材。种质资源圃的32个野菊种质,在叶形、叶基、叶耳、株高、茎色、花期、花径大小等形态性状方面表现出极大多样性。三、野菊优良种质的筛选与评价对野菊种质资源圃分别连续4年开展种质分株扩繁及纯化工作,达到圃内各种质外观表型特征一致。根据植株形态、花期差异等,优选6个野菊种质进行系统比较,6个种质分别为湖北新洲区种质、湖北罗田县种质、河南潢川县种质、安徽霍邱县种质、安徽舒城县种质、安徽桐城市种质。分析比较内容包括:野菊农艺性状、叶表皮电镜扫描、叶片超微结构、野菊花产量、野菊花形态结构、野菊花花粉形态、野菊花化学成分。安徽桐城市种质,在株高、冠幅、花序直径、百花干重和花单株产量等诸方面均大于其它种质,说明安徽桐城市野菊种质产量最高。湖北新洲区种质腺体分布最多,可作为抗虫种质培育。湖北罗田县种质表皮毛臂最长,可以作为耐低温种质材料进行育种。安徽霍邱县种质皮孔密度小、面积小,在耐受干旱、大风等自然条件方面有优势。安徽舒城县种质气孔密度大,更适合生长在温暖湿润的气候下。依据药典标准,湖北新洲区种质(早花型)、湖北罗田县种质(中花型)、安徽霍邱县种质(晚花型)的野菊花中蒙花苷含量合格,而其它种质均不合格。目前可优选此三个合格种质,开展规范化、规模化GAP种植,以避免采花时间过度集中,引起劳动力紧缺而造成野菊花来不及采摘的浪费,并使野菊种质多样化,丰富野菊资源。四、基于化学成分的野菊品质评价本研究选取了不同区域产118个野菊花药材进行了蒙花苷的定量分析,对比不同省份蒙花苷含测表明,湖北省产野菊花的蒙花苷含量合格率为最高(55.6%),所有合格品中,以湖北新洲区含量最高(2.02%),总的结果比较,湖北更适宜作为企业野菊花药材采购的来源地及GAP推广种植地。118个样品中,仅有25个样品符合药典规定,合格率仅为21.2%。表明药典仅仅以蒙花苷含量判定野菊花合格与否值得深入探讨。因此,为建立更为合理的野菊花评价体系,本研究建立了UPLC法同时测定野菊花中6种化学成分的定量分析方法和UPLC-Q-TOF/MS技术在线鉴定野菊花中化学成分的定性分析方法。采用料液比1:250,70%甲醇超声处理30min作为提取条件,色谱条件选择乙腈:水(50:50,0.1%甲酸,A)-乙腈:水(2:98,0.1%甲酸,B)为流动相,柱温40℃时,以326 nm为检测波长,6个峰的响应值均较大,可以较好的对野菊花中绿原酸、蒙花苷、3,5-二咖啡酰奎宁酸、木犀草素、芹菜素和刺槐素含量进行定量分析。应用UPLC-Q-TOF/MS技术对野菊根、茎和叶中主要化学成分进行在线快速定性分析。结合精确分子量、MS~E质谱碎片、色谱峰保留行为,鉴定野菊根、茎、叶中8个化学成分,包括4个酚酸类(绿原酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸)、1个黄酮类(刺槐素)、2个黄酮苷类(蒙花苷、金合欢素苷)和1个野菊花内酯。应用UPLC-Q-TOF/MS技术对野菊花化学成分进行在线快速定性分析。鉴定野菊花中14个成分,包括4个酚酸类(绿原酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸),3个黄酮类(木犀草素、芹菜素、刺槐素)和7个黄酮苷类(蒙花苷、木犀草素-7-O-β-D-芸香苷、木犀草苷、芹菜素-7-O-β-D-芸香苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、香叶木素-7-O-芸香苷、刺槐素7-O-6-O-α-L-鼠李糖-β-槐糖苷)。表明野菊花中化学成分多样。对野菊生长不同时间(5月15日、9月15日和11月15日)和部位(根、茎和叶)8个主要化学成分进行半定量分析,结果显示,酚酸类成分在根中均含量较高;绿原酸和3,5-二咖啡酰奎宁酸在茎和叶中含量较高;黄酮类成分在叶中含量最高,在根中含量最低;野菊花内酯在叶中含量最高。从时间轨迹上来看,除刺槐素和4,5-二咖啡酰奎宁酸外,其他成分均在11月份含量最高。表明可以在10月底、11月初采花后,再采收其它部位,实现对野菊的综合合理开发利用。将根、茎、叶与常规入药部位花进行比较,结果显示,酚酸类成分在花中含量最低,而黄酮类化合物(除金合欢素苷外)在花中含量最高,金合欢素苷在叶中含量最高,而在根和花中最低。野菊花内酯在叶中含量最高,而在根和花中未检测到;木犀草素和芹菜素为花中特有成分,野菊根、茎、叶中未检测到,可以作为野菊花TLC鉴别项,为完善野菊花鉴别项质量标准提供科学依据。五、基于SSR分子标记的野菊遗传多样性评价对资源调查收集的86个野菊样品,开展基于SSR分子标记的遗传多样性分析,以湖北罗田县种质的混合组织样品为材料进行转录组测序,优选多态性良好的20对引物,鉴定86个样品中有70个样品具有基因型唯一性,使用其中多态性好的4对引物即可达88.6%复合鉴定成功率,是制定野菊种质分子指纹图谱的优选。对比湖北罗田县、安徽舒城县两种质转录组结果,两个种质整体转录组同源性很高,但两种质特有同源基因差异较大;从进化生物学角度研究单拷贝种质共有同源基因,两种质在“已经历正向选择基因”方面差异较大,而在“正经历正向选择基因”方面相似。