论文部分内容阅读
鱼类胰蛋白酶是鱼类消化酶的一种,属于丝氨酸蛋白酶家族,对鱼类食物蛋白质的消化具有重要的生理作用。胰蛋白酶来源于鱼类的胰脏、肠道和幽门盲囊。胰蛋白酶是以无活性的酶原形式存在于鱼类胰脏中,被肠激酶或有活性的胰蛋白酶自身激活,分子构象发生一定改变后转变为有活性的胰蛋白酶。罗非鱼为内陆热带性鱼类,由于其生长快、食性杂、病害少、抗病力强、适应性广等特点,使罗非鱼成为国际上被引种养殖最广泛的鱼种。对罗非鱼的胰蛋白酶进行研究,是了解其消化生理的重要内容,同时对于罗非鱼养殖过程中饵料的应用亦具有重要意义,也可为一直作为下脚料的内脏的合理回收利用提供理论基础。本研究主要是对罗非鱼胰蛋白酶进行分离纯化、性质研究,并进行了对蛋白酶解动力学及消化率的离体研究,具体研究如下:1.罗非鱼胰蛋白酶的纯化将罗非鱼解剖取出肝胰脏,用预冷双蒸水淋洗,沥干后加入四倍体积的Tris-HCl缓冲液,匀浆后过夜,离心取上清,得到粗提液。粗提液用30-70%硫酸铵分级沉淀,离心收集沉淀溶解得粗酶液,透析过夜。透析后的提取液先用HiTrap Benzamidine FF(high sub)亲和预装柱纯化,用pH3.0的甘氨酸-HCl洗脱,收集具有胰蛋白酶活性的洗脱峰进行离子交换,离子交换填料采用Amersham公司的DEAE-SepharoseTM Fast Flow(1.2×20cm),用含0-0.5M NaCl的Tris-HCl缓冲液进行梯度洗脱,收集具有胰蛋白酶活性的洗脱峰。用考马斯亮兰蛋白测定试剂盒测定各步收集组分的蛋白质含量,以TAME为底物,测定各步收集组分的胰蛋白酶活性,计算产率和纯化倍数来确定各阶段的纯化效果,测得罗非鱼胰蛋白酶的最终的产率为33.9%,纯化倍数达到了约170倍。2.罗非鱼胰蛋白酶性质的研究用5%的浓缩胶和12%的分离胶进行SDS-PAGE电泳,最终纯化得到的罗非鱼胰蛋白酶呈现出单一条带。并测得罗非鱼胰蛋白酶的分子量为24.3KDa。以BANPA为底物,测得罗非鱼胰蛋白酶的动力学常数(Km)为0.087mM。设定不同的温度和pH值,以TAME为底物测得罗非鱼胰蛋白酶的最适反应温度为65℃,最适反应pH为8.0。胰蛋白酶在60℃以下活性很稳定,60℃以上迅速失活。胰蛋白酶在pH6.0-10.0范围内稳定性较高,在酸性条件下活性丧失的要比在碱性条件下快。纯化后的罗非鱼胰蛋白酶分别加入不同浓度的金属离子和抑制剂处理30min后,以TAME为底物测定剩余酶活性进行比较,结果表明,Na+、Mg2+对胰蛋白酶的活性并无明显影响,Zn2+对胰蛋白酶的活性有轻微的抑制作用,K+对胰蛋白酶的活性有较强的抑制作用,Cu2+对胰蛋白酶的活性影响为先激活后抑制;β-巯基乙醇和EDTA钠对胰蛋白酶活性的抑制作用较弱, PMSF和苯甲脒对胰蛋白酶活性均有较强的抑制作用。3.罗非鱼胰蛋白酶对蛋白酶解动力学及消化率的离体研究在离体条件下测定并比较了纯化的胰蛋白酶对酪蛋白、牛血清白蛋白、水解乳蛋白、豆粕、菜粕、棉粕和鱼粉的消化率和酶解动力学。结果表明,其氨基酸生成速度为:酪蛋白>水解乳蛋白>牛血清白蛋白>棉粕>菜粕>豆粕>鱼粉。罗非鱼胰蛋白酶对豆粕、菜粕、棉粕和鱼粉四种饲料蛋白原料中棉粕的消化能力较强,鱼粉的消化能力最差。