视觉的形成依赖于光感受器细胞与视网膜色素上皮(Retinal pigment epithelium,RPE)之间功能的相互协调作用,这种稳态的破坏可能导致失明。因此,RPE与视网膜之间的相互作用在发育阶段以及成年视网膜的正常功能中至关重要。成熟的人视网膜是中枢神经系统种一种复杂而精细的感觉器官,缺乏再生能力。因此,对人视网膜的任何损伤都可能导致视力下降甚至失明。日常生活中,视网膜直接暴露在强光下或者受到有害因素的影响都会容易导致光感受器细胞退化和死亡。正常生理功能的RPE能够通过多种途径来减轻这些有害因素对视网膜功能的影响。此外,RPE对于视网膜外层的正常生理至关重要,具有对脱落的光感受器细胞外段的吞噬作用以及神经营养和血管营养类型生长因子的分泌功能。源自人诱导多能干细胞(hiPSC)的视网膜类器官(Retinal organoid,RO)重构了人视网膜的三维结构,模仿了人类视网膜的发育,并为临床前视网膜移植提供了细胞来源。然而,体外RO-RPE共培养能否促进RO中光感受器细胞的分化成熟仍然未知。在本文中,我们在体外成功地通过连续的诱导过程将hiPSC分化成为RO。在分化过程中,RO的神经视网膜标志基因表达模式在时间和空间上模仿了体内视网膜发生过程中基因表达的情况。我们在不同的时间点将原代的小鼠RPE细胞与RO接触共培养。研究结果表明,RPE细胞加速了 RO中光感受器细胞的分化,RPE和RO之间的相互联系促进了光感受器细胞基因在特定分化阶段的表达水平。我们的结果证实RPE对于视网膜的正常功能维持至关重要,RPE的任何功能异常似乎都会极大地影响等同于胚胎视网膜阶段的RO的分化。此外,我们证明了 RPE和RO的直接接触对于体外RO分化过程中促进光感受器细胞基因的表达是必不可少的。因此,我们的工作建立了一个共培养系统,该模型是模拟人视网膜发育过程种的视网膜与RPE之间的动态相互作用来设计的,可能能在未来用于视网膜相关疾病的治疗。我们的工作为视觉生理学和基于视网膜的干细胞模型的深层组合开辟了新途径。然而,RPE促进RO中光感受器细胞发育和成熟的分子机制还需要进一步研究。我们建议将CRISPR/Cas9技术与干细胞分化相结合,将提供一个更好的平台来加速分化进程以及深入研究分化过程中的转录组动态变化。在第二部分研究中,我们使用CRISPR/Cas9敲除了 hiPSC(BCl-eGFP)细胞系基因组中的NRL基因,以了解NRL基因在体外视网膜发生过程中的功能。干细胞向视杆细胞的分化需要较长的时间,提供了一个有足够时间跨度的模型来研究分化过程中的转录组动态变化和基因调控网络,以揭示它们在独特的神经元形态特征和发育过程中的功能。另一方面,由于复杂的遗传性质和信号传导途径的相互依赖性,指导中枢神经系统中不同类型细胞分化和组装的基因调控网络尚未完全研究清晰。在模式动物的研究中,我们知道转录因子NRL参与了视杆细胞的命运决定,但NRL在人的视网膜发育过程中是否具有完全一样的功能我们还不知晓。因此,我们对hiPSC(BCl-eGFP)细胞系中NRL基因进行敲除,并比较敲除前后的细胞在人RO的体外分化过程中的转录组。我们通过CRISPR/Cas9技术,利用两个与NRL基因的CDS区域中的DNA序列互补的sgRNA,对特定的NRL DNA片段进行切除,成功建立了NRL基因敲除的细胞系。我们发现在hiPSC分化获得的RO中,敲除NRL会导致视杆细胞完全缺失,同时视锥细胞标记基因(如:R/GOPSIN基因和OPSIN1SW基因)的表达下调。此外,我们计划使用ATAC-seq和RNA-seq来探索NRL敲除前后光感受器细胞的染色质可及性变化和转录组变化以深入了解NRL基因在人视网膜发育过程中对光感受器细胞命运决定调控的特殊机制。这部分工作目前正在研究中。因此,我们的研究为人视网膜发育过程提供一个体外研究平台。