一、研究背景随着人民生活水平的日益提升和人口老龄化的逐年加重,冠状动脉粥样硬化性心脏病的发生率呈逐年上升趋势,在治疗冠心病的诸多方法中,给予缺血后心肌的再血管化处理是目前最常用和最有效的治疗手段之一。然而在心肌再血管化的过程中,心肌缺血再灌注(Ischemia reperfusion, IR)损伤是每一个心脏血管临床医师都必须面对,且无法有效治疗的困境。因而如何有效减少心肌IR损伤具有重要的现实意义。目前有研究表明：大量生成的氧自由基(Oxygen free radical, OFR)、心肌细胞内钙超载、细胞膜成分改变及其流动性降低、细胞膜通透性的增加等在IR损伤的发生和发展进程中起着主导性的作用。自由基主要包括非脂性自由基和脂性自由基,是维持正常生命活动所必须的物质。前者主要指OFR,包括超氧阴离子和羟自由基等。自由基作为人体正常的代谢产物,在非病理情况下,体内自由基不停地产生与清除,对危害机体的物质具有一定的积极防御作用；自由基过量释放或过量清除均能够对人体造成影响和损害,过量产生的自由基,特别是OFR,具有极强的氧化反应能力,能通过氧化作用攻击生命大分子,能改变细胞膜的组分,促进“脂质三联体”的形成,降低细胞膜的流动性,并可激活中性粒细胞,损伤线粒体,从而导致机体组织的结构和功能破坏。因此有文献报道,OFR是心肌IR损伤的直接原因之一,尤其对细胞膜的损伤作用较明显,这会导致细胞内钙超载,并形成恶性循环,最终导致细胞死亡。长久以来,尽管对IR损伤后在的氧化应激的预防及治疗方面的研究较多,但目前仍没有找到有效的抗氧化药物治疗心肌IR损伤。现有常见的氧自由基拮抗剂主要包括酶类清除剂和非酶类清除剂两大类,前者酶分子量大、稳定性不高、对理化因素较为敏感、透皮或透膜吸收困难；后者还原性强、选择性差,可能引起内源性氧化还原失衡。因此,寻找一种疗效明确、具有高选择性的自由基清除剂,已成为医学和生命科学等领域关注的重点。2007年有日本学者发现,氢能够通过特异性清除部分氧自由基发挥对IR损伤的保护作用,溶解在液体中的氢气可选择性中和IR过程中产生的羟自由基和过氧亚硝基阴离子。有部分学者新近研究发现,应用呼吸含氢的气体对肝脏、视网膜等器官的IR损伤也发挥着重要的保护作用。二、研究目的本研究应用大鼠在体心肌IR模型及离体心肌细胞缺氧复氧模型,通过明确分子氢对心肌细胞膜流动性的影响,对心肌细胞内钙稳态的影响,阐述分子氢心肌保护作用的可能膜分子机制,为氢治疗心肌IR损伤提供相关理论依据,同时为临床上治疗心肌IR损伤提供新思路。三、研究方法在体实验研究：将雄性成年SD大鼠随机分为5组：假手术组(实施开胸手术,并针线穿过左前降支下缘,并不结扎,关胸前给予腹腔注射20ml/kg生理盐水),IR组(结扎左前降支造成心肌缺血,30min后放松线结,再灌注前给予腹腔注射20ml/kg生理盐水,再灌注2h),氢饱和盐水处理组(心肌再灌注之前5min,通过腹腔给予注射不同浓度(5,10,20ml/kg)饱和H2生理盐水预处理,其余同IR组)。采用膜片钳及激光扫描共聚焦检测不同组之间钙离子通道流量的变化,应用电子自旋共振测定心肌细胞膜的流动性。离体实验研究：离体培养的乳鼠心肌细胞采用缺氧复氧模型来模拟在体心肌的IR损伤。将心肌细胞分为3组：对照组：5%二氧化碳和95%空气,37℃培养2.5h；IR组：5%二氧化碳和95%氮气,37℃培养30min,复氧培养2h；氢处理组：在缺氧复氧之前给予富氢培养基,其余处理同R组。应用CCK8方法比较各组心肌细胞活力,测定心肌细胞损伤的代谢功能指标(LDH、CK、cTn)等。并应用Western-blot及流式细胞方法测定不同组别间Bcl-2的活性,并测定心肌细胞凋亡率。四、研究结果(一)相较于假手术组,H2组和IR组大鼠的细胞膜总磷脂含量、胆固醇含量、细胞膜的整体流动性及区域流动性明显低于假手术组(P<0.05),虽然H2组大鼠细胞膜各项指标仍低于假手术组,但相较于IR组,H2组的这些指标明显改善(P<0.05),尤以20ml/kg改善最为显著(P<0.05),证明氢盐水能够影响IR过程中心肌细胞膜的整体流动性及区域流动性。(二)IR组的L型钙通道电流密度及钙火花发生频率明显高于假手术组,而H2组的电流密度水平和钙火花发生率虽然也高,但比较IR组明显降低,尤以20ml/kg改善最为显著(P<0.05),这提示分子氢可以有效改善异常增多的钙内流和异常增多的钙火花；IR组的钙瞬变峰值明显低于假手术组,而H2组的钙瞬变峰值虽然也较低,但较IR组明显升高,尤以20ml/kg改善最为显著(P<0.05),提示分子氢可以有效改善异常降低的钙瞬变,改善心肌收缩功能。(三)实验组心肌细胞活力显著低于氢处理组(P<0.05),而细胞损伤相关代谢指标显著高于氢处理组(P<0.05),提示氢盐水可以有效减少IR过程中对细胞功能的损害。(四)IR组心肌细胞的凋亡发生率显著高于H2组(P<0.05),凋亡抑制相关蛋白活性显著低于H2组(P<0.05),提示氢盐水可以有效减少心肌R过程中出现的凋亡现象,保护心功能。五、研究结论(一)一定浓度的H2可以影响心肌细胞膜脂的组分,并且影响心肌细胞膜脂的流动性。(二)一定浓度的H2可以影响跨膜蛋白L型钙通道的电流密度,并最终影响心肌细胞内的钙稳态。(三)一定浓度的H2抑制心肌细胞的凋亡,对缺血再灌注心肌的保护作用可能与其影响细胞膜脂流动性及膜蛋白的功能有关。