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目的为了克服现用流感疫苗免疫原性弱、不能有效诱导黏膜免疫应答、接种途径单一,病人顺应性差、副反应多等问题,本研究选择DDA/TDB阳离子脂质体为疫苗佐剂,构建DDA/TDB阳离子脂质体流感疫苗,并经过鼻黏膜免疫,以期获得能够诱导增强体液及黏膜免疫效应的流感疫苗,有效预防流感的流行,为新型疫苗的研究开发提供有价值的研究参考。方法1分别选取不同性质磷脂DSPC、DOTAP-DC、DDA-TDB,以甲型流感H3N2为抗原原液,采用薄膜分散法制备中性DSPC-Chol、阳离子DOTAP-DC-Chol和DDA-TDB脂质体流感疫苗,以粒径、Zeta电位、包封率(EE)、载药量(LD)为评价指标优选处方及工艺,并对所得脂质体流感疫苗进行特性评价。2培养小鼠骨髓树突状细胞(Bone Marrow Dendritic cells,BMDCs),采用激光共聚焦显微镜(Confocal laser scanning microscope,CLSM)及流式细胞仪(Flow Cytometer,FCM)检测未成熟BMDCs对量子点(QDs)标记的不同脂质体的体外摄取情况,考察不同脂质体递送抗原的能力。选取标志树突状细胞(Dendritic cells,DCs)成熟的细胞表面因子MHCII、CD80、CD86为指标,通过FCM检测各因子表达程度,考察不同脂质体流感疫苗刺激诱导BMDCs分化成熟能力。3以C57BL/6小鼠为动物模型,通过鼻黏膜免疫,采用间接酶联免疫吸附测定法(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测小鼠黏液分泌型IgA(sIgA)、血清IgG及IgG亚型的抗体效价和小鼠脾脏细胞因子IFN-γ、IL-2和IL-5的表达水平,对DDA/TDB阳离子脂质体流感疫苗的免疫效应进行初步评价。结果1采用薄膜分散法制备脂质体流感疫苗,优选抗原与脂质质量比(A/L)为10:100,分散介质为pH7.4的Tris-buffer,所得DSPC-Chol脂质体流感疫苗粒径500.3±21.0nm,Zeta电位-4.2±0.1mV,EE 17.8±1.9%;DOTAP-DC-Chol脂质体流感疫苗粒径339.0±3.9nm,Zeta电位51.3±2.0 mV,EE 46.2±1.1%;DDA-TDB脂质体流感疫苗粒径1770.0±70.7nm,Zeta电位53.8±3.6mV,EE 77.5±2.7%。透射电镜观察各脂质体形态呈圆球形或椭球形。4℃下放置21天,各脂质体粒径及包封率变化均不大,表明其稳定性较好。2体外摄取实验结果显示,DCs对DDA-TDB脂质体摄取能力明显增强,给药2h后阳性细胞数百分比可达32.73±2.6%,与DSPC-Chol组(4.9±1.8%)和DOTAP-DC-Chol(12.2±0.9%)组相比,有极显著性差异(p<0.01)。DCs细胞成熟实验结果显示,DDA-TDB脂质体能显著上调DCs表面共刺激分子CD80、CD86及MHC-II的表达水平(p<0.05),表明DDA-TDB脂质体能够促进DCs的分化成熟。3 DDA-TDB脂质体流感疫苗sIgA抗体滴度鼻黏膜免疫组显著高于腹腔注射免疫组(p<0.01)。经鼻黏膜免疫后,DDA-TDB组小鼠血清anti-H3N2 IgG滴度与H3N2原液、DSPC-Chol和DOTAP-DC-Chol组相比,具有显著性差异(p<0.01);DDA-TDB组IgG1和IgG2b抗体水平高于DSPC-Chol和DOTAP-DC-Chol组,呈显著性差异(p<0.05);DDA-TDB组IFN-γ水平高于DOTAP-DC-Chol组,差异显著(p<0.05);各组IL-2和IL-5水平无显著性差异。结论采用薄膜分散法制备了包封率较高、稳定性良好的DDA-TDB脂质体流感疫苗,其粒径为1770.0±70.7nm,PDI 0.356±0.044,Zeta电位53.8±3.6mV,EE 77.5±2.7%,LD8.7±0.3%。体外摄取实验结果显示,DCs对DDA-TDB组的摄取率明显高于DSPC-Chol与DOTAP-DC-Chol组,表明DCs对DDA-TDB脂质体摄取能力显著增强。DCs成熟实验显示,DDA-TDB脂质体能够上调DCs表面共刺激分子CD80、CD86及MHC-II的表达水平,证实了DDA-TDB脂质体能够刺激诱导DCs分化成熟。动物实验结果显示,经鼻黏膜免疫后,DDA-TDB组小鼠黏液anti-H3N2 sIgA和血清anti-H3N2 IgG、IgG1及IgG2b抗体滴度均高于其他三组,且细胞因子IFN-γ水平较高,表明DDA-TDB脂质体经鼻粘膜免疫能显著提高黏膜免疫、体液免疫及Th2类T细胞免疫应答效应,有希望成为新型疫苗佐剂。