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肺癌作为最常见的癌症之一,其发病率及死亡率一直以来都居高不下,其中约80%为非小细胞肺癌（NSCLC）。P53是非小细胞肺癌中突变率最高的基因之一,突变率大约为50%,其中比较常见的是R273H型突变。P53基因突变后（mut-p53）其肿瘤抑制功能丧失,还可获得不同于野生型p53（wt-p53）的新功能,被定义为功能增益（GOF）。这种GOF能够促进肿瘤恶性进展,包括增加肺癌细胞侵袭和转移。放疗是肺癌治疗的常规手段,可抑制肺癌细胞生长,降低肺癌的复发率。放疗带来的副作用也不可忽视,辐射后成纤维细胞转化为肌成纤维细胞,从而导致肺结构重塑。成纤维细胞分化为肌成纤维细胞,称为纤维细胞或来自上皮-间质转化（EMT）的上皮细胞。EMT是一个细胞过程,其中细胞失去其上皮特征并获得间充质特征。EMT与多种肿瘤功能有关,包括肿瘤恶性进展、肿瘤细胞迁移、转移和对治疗的抵抗,与肿瘤的发生、侵袭和转移密切相关。然而目前辐射诱导肺癌细胞发生EMT的机制尚不清楚。早期生长反应因子1（EGR1）是一种转录因子,主要参与组织损伤、免疫反应和纤维化过程,EGR1与癌症的发生和发展密切相关,可能参与肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移和肿瘤血管生成。有研究表明,mut-p53蛋白可以与EGR1启动子区域结合,促进EGR1的表达,但这种作用机制是否参与辐射诱导肺癌细胞EMT的发生,有待进一步阐明。目的:通过在p53基因缺失的H1299细胞中构建稳定表达wt-p53和mut-p53的细胞模型,观察在电离辐射作用下,R273H型突变的p53对H1299细胞EMT表型的影响;观察稳定表达H1299-p53R273H细胞中EGR1的表达变化,探讨p53R273H对EGR1的调控作用,阐明p53R273H在电离辐射诱导的肺癌细胞发生EMT中的重要作用。方法:1.分别用0、6、8、10 Gy剂量的X射线辐射A549细胞和H1299细胞,在照射后的0、24、48h分别收集细胞,观察辐射对A549和H1299细胞EMT标志物的影响。2.采用划痕以及Transwell小室试验方法,观察A549和H1299细胞迁移、侵袭能力及稳定转染后的H1299细胞迁移和侵袭能力变化。3.利用慢病毒转染的方法分别将pLenti-CMV-p53和p Lenti-CMV-p53（R237H）稳定转染至H1299细胞中,构建H1299-p53WT和H1299-p53R273H细胞模型。4.采用流式细胞术检测H1299-p53WT和H1299-p53R273H细胞周期变化。5.采用Western Blot和q-PCR方法检测EMT标志物、p53、EGR1的表达变化。6.用CHIP实验方法验证p53与EGR1的调控关系。结果:1.辐射诱导A549细胞发生EMT用0、6、8、10GyX射线辐射A549细胞,并在0、24、48h检测细胞内EMT标志物的变化。结果显示,与对照组相比,8GyX射线辐射后,E-cadherin蛋白表达呈下降趋势,于辐射后48h下降最为明显;N-cadherin和Vimentin的蛋白表达水平呈上升趋势,于辐射后48h上调最为明显。相同的条件下检测H1299细胞中EMT标志物的变化,结果显示,随着辐射剂量的增加和时间的延长,E-cadherin表达增加、N-cadherin表达减少、Vimentin的蛋白表达水平未发生明显改变。2.辐射诱导A549细胞和H1299细胞迁移和侵袭能力的变化8GyX射线辐射A549细胞48h后,与对照组相比,A549细胞迁移的距离显著增加（p＜0.05）,提示电离辐射可以增加A549细胞的迁移能力;8GyX射线辐射H1299细胞24、48h后,细胞迁移距离并未发生明显改变。8Gy辐射A549和H1299细胞24h后,与对照组相比,可见下层小室内A549细胞数量明显增加（p＜0.01）,H1299细胞与对照组相比,也略有增加（p＜0.05）。3.构建H1299-p53WT和H1299-p53R273H细胞模型用慢病毒转染法将p53WT和p53R273H质粒转入H1299细胞,与对照组相比,H1299-p53WT和H1299-p53R273H细胞模型中,p53的m RNA（p＜0.001）和蛋白水平均明显升高;并观察到,H1299-p53WT细胞表现为圆形,而H1299-p53R273H细胞形态则表现为梭形,细胞骨架染色可见细胞微丝增多、伪足增加,呈现间质细胞形态。4.辐射诱导H1299-p53WT和H1299-p53R273H细胞EMT表型变化8GyX射线辐射48h后,与对照组相比,N-cadherin和Vimentin蛋白表达明显上调;8GyX射线辐射24h后,与对照组相比,H1299-p53R273H细胞迁移距离明显增加（p＜0.001）,细胞侵袭能力亦明显增强（p＜0.001）。H1299-P53R273H与H1299-p53WT细胞相比,细胞迁移和侵袭能力均显著增强（p＜0.01）;8GyX射线辐射后,H1299-p53WT细胞增殖能力降低（p＜0.01）,而H1299-p53R273H细胞增殖能力增强（p＜0.001）。5.辐射对H1299-p53WT和H1299-p53R273H细胞中p53、EGR1表达的影响8GyX射线照射48h后,与H1299-p53WT细胞相比,H1299-p53R273H细胞中p53、EGR1的蛋白表达水平明显增加,H1299-p53WT细胞中p53、EGR1表达未见明显变化;IF染色结果显示,H1299-p53R273H细胞中EGR1表达增加,且主要聚集在细胞核内。6.p53R273H与EGR1启动子区域结合的情况通过比较H1299-p53WT与H1299-p53R273H两种细胞模型,我们发现,在H1299-p53R273H细胞中,p53R273H与EGR1启动子区域结合能力较强。结论:1.P53参与了辐射诱导的肺癌细胞EMT过程。2.辐射可诱导H1299-p53R273H细胞中EGR1表达增加,并增加H1299-p53R273H细胞的侵袭、迁移和增殖能力。3.辐射可诱导p53R273H在EGR1启动子区域富集增多,促进EGR1表达。