缺血性中风是一种由于脑部血液循环中断或者不畅而引起的脑部疾病[1]。主要生理表现为脑部血管狭窄或者完全堵塞,脑组织出现缺血缺氧、损伤甚至死亡。缺血性中风会严重影响患者自身功能,临床一般表现为语言不利、口眼喁斜,半身不遂甚至死亡。该疾病的治疗给社会和家庭带来了沉重的负担[2]。目前,除了溶栓抗凝血治疗稳定病情外,其他治疗方法所取得的效果均不太明显[3]。随着研究的发现,脑部缺血会刺激脑内源性神经干细胞迁移至缺血部位,增殖并发育成熟神经细胞,这一系列反应可提高受损脑组织的认知功能。然而缺血诱导的新生神经细胞数目十分有限,因此深入了解缺血损伤后神经再生的机制,采取临床干预促进神经再生,对中风后的神经功能恢复具有至关重要的意义。研究表明自噬对保持干细胞的静息状态、维持多潜能干性具有非常重要的作用,神经再生过程中神经干细胞的自我更新、分化和增值等过程均与自噬相关。因此研究缺血后神经干细胞自噬状态为促进神经再生提供有效的实验依据。补阳还五汤是益气活血的代表方,出自清代王清任著《医林改错》一书[4]。由黄芪、赤芍、川芎、当归、地龙、桃仁、红花七药组成。其配伍特点是大剂量黄芪配伍小剂量活血祛瘀药,使气旺促血行,活血而不伤正,共奏补气活血通络之功[5]。根据中医对“气血—肾精—脑髓”的理念认识益气活血与内源性神经再生的密切关联[6]。传统的中药药理体外研究采用直接给药方法,但由于中药及中药复方成分复杂,以及直接给药法难以模拟体内真实环境,故提出血清药理学方法,即将中药或中药复方给动物灌服,取动物血清作为药物源进行体外实验。血清药理学方法弥补了直接给药法的不足[7],为中药药理的体外研究提供了新的思路。基于以上研究背景,现探讨补阳还五汤血清是否对缺氧缺糖/再灌注造成的神经干细胞损伤有保护作用,且初步探讨其保护作用机制,即是否通过调控自噬发挥作用。目的:本实验通过缺氧缺糖/再灌注损伤的大鼠幼鼠神经干细胞作为研究模型,采用血清药理方法探讨补阳还五汤对受损神经干细胞增殖、分化能力的影响,并初步探讨可能的机制。方法:大鼠随机分为两组,分别连续灌服补阳还五汤水煎液及等量蒸馏水,连续7天,灌药量2ml/只,每天2次。于第8日给药后1h经腹主动脉取血,静置离心,制备血清,灭活,以补阳还五汤含药血清为药物源进行实验。大鼠神经干细胞经过提取、分离、鉴定后连续培养三代以上,为下一步实验步骤做准备;采用缺氧缺糖/再灌注损伤(OGD/R)模型法模拟脑部缺血再灌注损伤,将分离培养三代后的神经干细胞分为3组。正常组:正常培养基培养神经干细胞,并将其置于正常CO2培养箱中培养;模型组:用无糖培养基培养神经干细胞,并置于三气培养箱中低氧(1%O2、5%CO2、94%N 2)培养2h后置于正常CO2培养箱中培养;补阳还五汤含药血清组:用无糖培养基并添加补阳还五汤含药血清来培养神经干细胞,并置于三气培养箱中低氧(1%O2、5%CO2、94%N2)培养2h。按上述条件培养2h后,将无糖培养基换成正常神经干细胞培养液,并将细胞置于正常培养箱中培养,其中给药组依然补阳还五汤含药血清,分别复氧24h后进行后续实验研究。为探讨补阳还五汤对缺氧缺糖/再灌注神经干细胞增殖、分化能力的影响及可能的机制,采用CCk-8法检测细胞活力,酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测乳酸脱氢酶(LDH)漏出量;荧光倒置显微镜拍照检测细胞增殖、分化状况;Western Blot检测Beclin1、Lc3II、p62水平。成果:经显微镜下观察由大鼠分离出的细胞形态饱满,圆球状,遮光性良好,免疫荧光鉴定标记物染色呈阳性,诱导分化后鉴定为神经细胞,说明提取细胞为神经干细胞。cck-8检测结果显示与正常组比较,模型组神经干细胞细胞活力显著降低(p<0.01);与模型组比较补阳还五汤中、高剂量组显著提高细胞活力(p<0.05,p<0.01)。LDH检测结果显示与正常组比较,模型组神经干细胞LDH漏出率显著升高(p<0.01);与模型组比较补阳还五汤中、高剂量组显著减低细胞LDH漏出率(p<0.05p<0.01)。免疫荧光检测显示补阳还五汤中、高剂量组显著提高细胞增殖、分化能力(p<0.05,p<0.01)。Western blot结果显示与正常组比较,模型组LC3-Ⅱ,Beclinl蛋白表达明显升高,p62蛋白表达明显下降;与模型组比较,补阳还五汤组LC3-Ⅱ和Beclin1蛋白及表达均明显降低,p62蛋白表达明显升高,差异均具有明显性(P<0.05)。结论:补阳还五汤可改善OGD/R神经干细胞损伤和自噬,减轻细胞LDH漏出率,调节自噬活性,可能与下调LC3-Ⅱ,Beclin1表达,上调p62表达有关。