黄瓜组织培养与农杆菌介导的遗传转化体系研究

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黄瓜(Cucumis sativus L.)是我国主要蔬菜作物之一,在国内栽培面积较大,居世界蔬菜栽培面积的第4位。长久以来,国内外育种家们利用传统的育种方法育出了大量的优良品种,但不能突破优良性状在较大范围物种间传递的限制。随着生物技术的迅速发展,通过植物基因工程进行作物遗传改良已成为传统育种的有效补充。农杆菌介导的遗传转化为黄瓜育种提供了一条有效的方法。本试验建立了稳定的黄瓜再生、遗传转化体系,并将GUS报告基因导入3个基因型的黄瓜基因组中。主要结果如下:1.优化了不同黄瓜外植体和基因型的再生条件(1)子叶外植体:黄瓜2~3d的子叶在MS附加1.0mg·L-1 6-BA和1.0mg·L-1AgNO3的培养基中再生最好。基因型对黄瓜子叶再生的影响差异显著,再生频率最高的是自交系‘IL 69’,其再生频率为94%,其次是‘IL 103’和‘IL 67’,再生频率分别为88%和87%,而‘IL 101’的再生频率仅为15%。比较适宜的黄瓜子叶再生芽增殖和伸长培养基配方分别为:MS+2.0mg·L-1 6-BA+1.0mg·L-1 AgNO3和MS+0.1~0.2mg·L-1 6-BA。研究了AgNO3对黄瓜子叶再生的影响,浓度为1.0mg·L-1 AgNO3可以有效促进黄瓜离体子叶的再生和再生芽的增殖。(2)黄瓜火烈鸟状外植体(flamingo-bill explant,FBE):4~5d苗龄,切去一片子叶和生长点的FBE在MS附加0.5mg·L-1 6-BA的培养基中即可再生,再生率达到96%;FBE再生芽的诱导率在基因型间无显著差异。(3)黄瓜再生芽的生根:2~3cm的再生芽在MS培养基中生根情况良好。2.确定了组培苗的嫁接条件以苗龄为1叶1心的云南黑子南瓜作砧木,高度为2.5cm的黄瓜再生芽作接穗,进行嫁接,成活率可达100%;嫁接苗生长势显著高于黄瓜自根苗。3.优化了抗生素的使用浓度(1)卡那霉素(Kanamycin,Kan):非转化子叶抗性测验表明:100mg·L-1的Kan能完全抑制黄瓜自交系‘IL 69’、‘IL 103’和‘IL 67’的子叶再生,可作为转化植株初步筛选的适宜浓度。非转化FBE抗性测验表明:125mg·L-1的Kan完全抑制黄瓜自交系‘IL 69’、‘IL 103’和‘IL 67’的FBE再生,可作为FBE转化植株初步筛选的适宜浓度。Kan对再生芽生根的影响:30mg·L-1的Kan完全抑制了黄瓜自交系‘IL 69’、‘IL 103’和‘IL 67’的子叶和FBE再生植株的生根,可作为以上3个自交系转化植株生根时的Kan筛选浓度。(2)头孢霉素(Cefotaxime,Cef):Cef浓度在100~400 mg·L-1范围内对黄瓜子叶和FBE不定芽诱导的抑制作用不明显。选用400 mg·L-1 Cef作为转化植株抑菌培养的初始浓度,继代培养时可逐步降低其浓度至100 mg·L-1。4.获得了转基因植株(1)抗性植株的叶片和根的X-gluc组织化学检测表明,GUS基因已转入黄瓜基因组。(2)提取组织化学检测呈阳性植株的DNA,经PCR检测证明,外源基因已整合入黄瓜基因组中。并获得黄瓜自交系‘IL 69’、‘IL 103’和‘IL 67’的转基因再生植株。5.两种转化法的比较农杆菌介导的黄瓜FBE转化法的转化率不但高于子叶转化法,而且FBE转化法大大简化了农杆菌介导的遗传转化程序,加快了转化进程20~25 d。
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