研究背景目前,肿瘤仍然是导致死亡的主要原因之一,而恶性肿瘤的主要死因是转移复发。恶性肿瘤根治术后发生转移通常化疗效果不理想,预后较差。因此,对掌握肿瘤如何发生转移进而研究如何阻断转移对减缓肿瘤的进展,降低死亡有重要意义。目前认为肿瘤的转移主要经过局部浸润、渗入血管、血循环中存活、血管外渗、转移灶内定植的过程。早在百年前Paget的“种子和土壤”学说就已经强调了肿瘤转移过程的两个重要方面:转移肿瘤细胞作为“种子”的播散作用,以及肿瘤转移靶器官微环境作为肿瘤细胞转移定植的“土壤”作用。除外肿瘤细胞自身具有转移的生物学特征能促进其转移,近年来,随着对表观遗传学(Epigenetics)概念的深入了解,越来越多研究表明表观遗传调节对肿瘤的进展、转移密切相关。表观遗传学主要是指在基因序列不发生改变的基础上,基因表达发生可遗传变化的学科领域,表现为基因的转录调控和转录后调控,主要包含甲基化调控、microRNA调控和组蛋白修饰。目前众多研究表明,表观遗传调控不仅在肿瘤细胞本身起到重要的调节作用,而且在肿瘤细胞微环境例如纤维细胞等间质细胞中也起到重要的调控作用,在转录后水平调节微环境适应肿瘤细胞发展及转移。研究目的及内容本文主要以转移率较高的结直肠癌和胰腺癌为例研究microRNA、甲基化等表观遗传在肿瘤转移中的调控作用。研究主要内容包括两个部分:(一)microRNAs对结直肠癌肝转移的作用;(二)胰腺癌相关成纤维细胞的甲基化调控在胰腺癌肝、肺转移作用研究。第一部分我们以伴或不伴肝转移的结直肠癌组织microRNAs芯片谱起始,发现了伴肝转移结直肠癌原发灶内12个显著差异表达的microRNA,其中miR-320b在伴肝转移组显著上调,进而我们通过增殖及侵袭试验验证了 miR-320b能促进结直肠癌肿瘤细胞的增殖和侵袭,并通过对miR-320b靶蛋白表达量变化检测验证其机制可能是通过竞争其同源的miR-320a靶向下游的β-catenin,Rac-1和Neuropilin-1蛋白,起到促进肿瘤进展的作用。第二部分,考虑到胰腺癌具有典型的丰富的癌性间质的特征,是研究肿瘤微环境的典型模型,因此我们选用了胰腺癌来具体研究表观遗传在肿瘤微环境中的调控作用。以KPC转基因小鼠为模型,我们成功分离了胰腺癌原发灶及肝肺转移灶内肿瘤细胞系和肿瘤相关成纤维细胞系(CAFs),发现并在体外验证了 ALDH1a3和NQO1基因在肝转移灶的CAFs中被特异性甲基化上调,而肝脏转移的胰腺癌肿瘤细胞能特异性诱导转移灶微环境中CAFs内ALDH1a3和NQO1甲基化的上调。进而通过人胰腺癌及纤维细胞共培养后甲基化芯片谱发现了人胰腺癌肿瘤细胞能诱导纤维细胞内包括ALDH1a3及NQO1在内的糖代谢及ATP代谢通路基因整体甲基化上调,由此我们提出了可能的机制:“乳酸梯度”假设。为后续的研究提供了方向。结论与创新本研究第一部分我们通过结直肠癌肝转移来研究表观调控对肿瘤细胞(“种子”)的作用。目前为止,对结直肠癌肝转移相关的microRNA研究不多,在“第一部分:microRNA对结直肠癌肝转移”研究中所纳入的伴肝脏转移病例数是同类研究中最多,且本研究是第一次报道了在结直肠癌肿瘤细胞中,同源miR-320b和miR-320a可能通过相互竞争来实现相反的调控作用,为解释哺乳动物细胞内普遍存在的同源microRNAs的作用提供了新的思路和证据。在研究的第二部分,我们通过微环境丰富的胰腺癌来研究表观调控对微环境(“土壤”)的作用。胰腺癌伴肝转移的机制目前尚不清楚,且对胰腺癌肿瘤细胞与微环境如何相互作用尤其是表观调控作用,进而影响胰腺癌细胞肝等特异性转移的机制还未有报道。我们首次验证了胰腺癌肿瘤细胞与成纤维细胞之间的相互直接作用下,诱导了纤维细胞中ALDH1a3和NQO1的高甲基化,且可能是胰腺癌肝脏特异转移的机制之一。且通过人细胞系芯片谱的分析,提出了人胰腺癌肿瘤细胞通过诱导纤维细胞内包括ALDH1a3及NQO1在内的糖代谢及ATP代谢通路基因整体甲基化上调,形成肿瘤细胞与间质环境之间“乳酸梯度”的假设。