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背景与目的
急性缺血性脑卒中因高发病率、高致残率和高死亡率，已成为一个全球化健康问题。而其中，大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）的发生率又远高于其他脑动脉闭塞；因此，MCAO在缺血性脑卒中占有非常重要的地位。MCAO患者的临床表现各异，有的梗死体积小，经治疗后可无遗留的神经功能缺损；而有的梗死体积大，甚至最终因梗死体积进一步扩大而导致死亡；而影响卒中梗死体积、临床严重程度以及预后的重要因素之一正是软脑膜侧支循环的建立。
侧支是指存在于大多数组织中的连接相邻树状动脉群的动脉结构，可通过改变血流通路而向闭塞血管的供血区提供逆向血流灌注。根据侧支循环的代偿层次，人类脑侧支循环可分为三级。其中，作为二级侧支循环的软脑膜侧支是存在于大脑皮层表面的血管网络，可连接双侧大脑前动脉、大脑前动脉与大脑中动脉、大脑前动脉与大脑后动脉、大脑中动脉与大脑后动脉的末端。当大脑中动脉近端闭塞时，作为一级侧支的Willis环不再能提供有效的侧支血供，而次级侧支——软脑膜侧支则为缺血半暗带提供关键营养支持，起到维持脑血流量并且减少脑梗死体积的作用。大量的临床研究表明，具有良好软脑膜侧支的MCAO患者其梗死体积更小，神经功能缺损更轻，临床预后更好。此外，针对血管再通治疗的研究发现，软脑膜侧支良好的患者对血管内治疗的反应更好，出现症状性颅内出血的风险更低，神经功能恢复更好；而即使在再灌注不理想或未达到完全的血管再通的情况下，良好的侧支循环仍可通过促进脑血流灌注，而起到有效抑制缺血半暗带向梗死进展的作用。因此，准确而及时地评估MCAO患者软脑膜侧支状态（leptomeningeal collateral status, LMCs），无论对于患者的个体化治疗方案的确定还是对其临床预后的判断都极为重要。
目前，判断脑梗死后软脑膜侧支循环方法主要以影像学评估为主。虽然数字减影血管造影（digital subtraction angiography，DSA）是评价各级侧支的金标准，但在无条件或不适合进行该检查的情况下，CT血管成像技术（CT angiography，CTA）可作为评估软脑膜侧支状态的首选。然而，基于CTA的LMCs的评估并不能直接观察到这些小的动脉间连接，而是依赖于通过这些侧支血管接收血流的动脉灌注的程度和速率而间接评估软脑膜侧支状态。同时，完成影像学检查需要一定的时间和患者的配合度，上述因素以及检查者的熟练程度都将不同程度地影响成像结果，从而影响评估结果。由此看出，仅从影像学评估而确定患者软脑膜侧支代偿能力存在一定缺陷，特别是对于在血管内治疗时间窗内的患者，及早地评估软脑膜侧支代偿程度对于患者治疗方案的选择至关重要。因此，我们需要寻找其他方法，以提高评估软脑膜侧支状态的准确性和全面性。由此可见，探索软脑膜侧支相关因子，寻找脑梗死软脑膜侧支循环的预测和治疗靶点，从而对急性大脑中动脉闭塞性脑梗死进行有针对性的个体化治疗和预防，已成为急性脑梗死研究的新方向，具有重要的临床意义。
研究表明，软脑膜侧支于胚胎期开始形成。基因调控及环境因素，对这一过程产生着举足轻重的影响，并最终导致软脑膜侧支状态差异的形成。而这其中，基因调控是决定脑梗死后软脑膜侧支状态的至关重要的因素。那么，在影响缺血性卒中患者侧支循环的庞大基因调控网络机制中，如何找到一个在侧支循环形成与开放中起到至关重要作用的角色，能起到“牵一发而动全身”效应的靶点呢？因此，本研究中，我们首先通过基因芯片（microarray）以及实时定量聚合酶链式反应（quantitative real time polymerase chain reaction，RT-PCR）等技术，探索在人类发生急性脑梗死后，与软脑膜侧支建立相关的基因。
我们首先采用了基于CTA的区域软脑膜侧支循环评分（Regional leptomeningeal collateral，rLMC）评分系统，以评估MCAO患者的LMCs状态。我们根据rLMC评分，将急性脑梗死患者分为软脑膜侧支不良（rLMC评分≤10分；LMCs不良组）和软脑膜侧支良好组（rLMC评分＞10分；LMCs良好组）；同时也纳入无脑梗死的健康对照组。我们通过基因芯片技术，检测LMCs不良组、LMCs良好组以及健康对照组人外周血中长链非编码RNA（long non-coding RNA, lncRNA）的表达谱（共91007个lncRNA探针），进行差异表达lncRNA筛选，并进一步通过RT-PCR技术对差异表达的lncRNA进行验证，以期发现与脑梗死后软脑膜侧支状态相关的lncRNA。
另外，本研究中所使用的lncRNA基因芯片中还包含了29857个信使RNA（message RNA, mRNA）探针。而在前期的基因芯片筛查中我们意外地发现，排斥性导向分子a（repulsive guidance molecule, RGMa）的mRNA在LMCs不良组中有表达上调趋势。有趣的是，我们团队在前期的研究中发现， RGMa在小鼠缺血性脑卒中的血管新生过程（angiogenesis）中发挥负性调控作用；而体外实验也发现，RGMa对血管内皮细胞的增殖、迁移和小管形成均有显著的抑制作用；这些发现表明RGMa在血管形成中起重要作用并且可以导致内皮细胞功能障碍。另有研究表明，内皮细胞功能障碍会导致小鼠软脑膜侧支建立受损。由此，我们大胆推测RGMa可能与脑梗死患者软脑膜侧支状态相关。因此，我们再次通过RT-PCR技术，检测LMCs不良组、LMCs良好组以及健康对照组人外周血中RGMa的mRNA表达，以验证在人类脑梗死后RGMa与软脑膜侧支状态的关系。
除基因调控外，环境因素也与软脑膜侧支状态密切相关。相关研究发现：高龄、代谢综合征、高尿酸血症等危险因素会使血管调节能力和内皮功能下降，从而导致二级软脑膜侧支代偿能力下降。因此，在以往的临床研究中，高龄患者行血管再通治疗通常被认为是风险高于获益的：与年轻患者相比，超高龄患者在接受机械取栓（endovascular thrombectomy，ET）治疗后90天不良结局的风险要高得多。随着人类预期寿命的延长，这类高龄人群中MCAO的患者数量已显著增加。在我们的临床工作及研究过程中，我们也发现了越来越多的高龄（年龄≥80岁）、甚至是超高龄（年龄≥90岁）的MCAO患者。目前的大型临床试验中已观察到对于合并MCAO的急性脑梗死，经影像学筛选具有缺血半暗带的患者行机械取栓（ET），其预后要远远优于单纯行静脉溶栓（intravenous thrombolysis，IVT）的患者。而既往针对老年患者的临床研究却一般仅单纯采用“时间窗”概念来筛选患者，并没有采用基于“组织窗”的影像学评估来筛选符合血管再通治疗条件的超高龄患者。那么，在老年患者尤其是超高龄患者中经影像学筛选后行ET的疗效及安全性又如何呢？
研究发现，在各种影像学筛选方法中，与CT灌注扫描检查相比，尽管使用MRI筛选行ET的患者从发病至治疗的时间可能有所延迟，但最终的预后与影像学结果比较差异无统计学意义。其中，基于急性脑缺血病理生理影像的多模式核磁共振（magnetic resonance imaging， MRI）序列的磁共振弥散加权成像（Diffusion-weighted MR imaging， DWI ）/磁共振液体衰减反转恢复序列（ Fluid-attenuated inversion recovery imaging，FLAIR）不匹配可评估核心梗死和缺血半暗带，而FLAIR 序列中的液体衰减反转恢复血管高信号征（ Flair vascular hyperintensity，FVH）反映了软脑膜侧支循环形成及潜在可拯救的脑组织，大脑外侧裂的FVH可作为MCAO患者侧支循环的独立预测指标；因此，DWI/FLAIR（FVH）不匹配实际是对急性脑梗死患者进行病理生理组织窗及软脑膜侧支状态的综合评估；DWI/FLAIR（FVH）可识别最有可能受益于血管再通的超高龄患者，其指导下的MCAO患者的再灌注治疗更加安全、有效。因此，在本次的临床研究中，我们也将对经DWI/FLAIR（FVH）不匹配筛选的超高龄患者行ET治疗的疗效及安全性进行探讨，以期为我们今后的临床工作提供更多参考。
方法：
第一部分
前瞻性纳入合并大脑中动脉M1段＋/-颈内动脉（intracranial carotid artery，ICA）闭塞的超急性期脑梗死患者：所有患者从首次发现症状至到达医院的时间均小于24小时；并在同时期纳入无脑梗死的健康对照组。所有脑梗死患者入院后立即完善头颅CT平扫及头颈部CTA检查，并通过rLMC评分系统评价软脑膜侧支开放程度。根据软脑膜侧支状态，将脑梗死患者分为：软脑膜侧支循环不良（rLMC评分≤10分；LMCs不良组）和软脑膜侧支循环良好组（rLMC评分＞10分；LMCs良好组）。使用外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells， PBMCs）作为lncRNA的来源，通过lncRNA基因芯片（SBC Human [4*180K] lncRNA）技术，分析三组受试者外周血中lncRNA的基因表达谱；并对发现有差异表达的lncRNA进行扩大样本量验证，以探索与脑梗死患者软脑膜侧支不良相关的lncRNA。采用接收者工作特征曲线（Receiver operating characteristic，ROC）检验lncRNA预测脑梗死患者软脑膜侧支不良的能力，并最终通过Cis和Trans分析进一步预测lncRNA的靶基因。
第二部分
1.前瞻性纳入合并大脑中动脉M1段＋/-颈内动脉闭塞的超急性期脑梗死患者（所有患者从首次发现症状至到达医院的时间均小于24小时）。在同一时期，纳入无脑梗死的健康对照组。所有脑梗死患者入院后立即完善头颅CT平扫及头颈部CTA检查，并通过rLMC评分系统评价软脑膜侧支的开放程度。根据软脑膜侧支状态，将脑梗死患者分为：软脑膜侧支不良（rLMC评分≤10分；LMCs不良组）和软脑膜侧支良好组（rLMC评分＞10分；LMCs良好组）。我们通过RT-PCR技术，检测各组受试者PBMCs中RGMa mRNA表达。采取单变量分析检验LMCs不良组、LMCs良好组及健康对照组间临床资料及RGMa mRNA表达水平的差异；通过多元Logistic回归模型，分析脑梗死患者发生LMCs不良的独立预测因子；采用Spearman检验RGMa mRNA水平与LMCs状态的相关性；通过ROC曲线以检验RGMa预测脑梗死患者软脑膜侧支不良的灵敏度和特异性。通过上述方法，探索在MCAO患者中，RGMa与脑梗死LMCs状态的相关性。
2.根据90天改良Rankin评分（modified Rankin scale，mRS），进一步将患者分为：预后良好组（90天mRS≤2）和预后不良组（90天mRS＞2）。采取单变量分析以及多元Logistic回归模型，探讨脑梗死患者发生良好预后的独立预测因子。
第三部分
纳入符合以下入选标准的患者，进行回顾性分析：1）年龄≥90岁；2）颈内动脉和/或大脑中动脉M1和/或M2段闭塞所引起的急性脑梗死；3）MRI显示DWI/FLAIR（FVH）不匹配（DWI上表现为高信号，而在相应的T2加权FLAIR图像上未见明显异常信号，且大脑外侧裂存在点状、线状或管状的FLAIR高强度信号）；4）发病24小时内接受了血管再通治疗。根据血管再通治疗方案，将患者分为IVT组（只接受静脉溶栓）和ET组（接受了机械取栓或桥接治疗）。主要预后指标包括早期神经功能改善、90天mRS评分（mRS≤2定义为临床预后良好）、住院期间及 90 天死亡率，以及治疗后症状性颅内出血（symptomatic intracranial hemorrhage，SICH）发生率。采取单变量分析检验比较两组间临床资料及预后的差异，采用多元Logistic回归模型寻找超高龄患者发生SICH的独立预测因子。
结果
第一部分
1.首先纳入3名无脑梗死正常人（健康对照组）、3名软脑膜侧支良好患者（LMCs良好组）以及3名软脑膜侧支不良患者（LMCs不良组）进行lncRNA基因芯片分析。基因芯片结果显示，在外周血中， LMCs良好组与健康对照组比较，共336个lncRNA存在差异表达（差异倍数＞2，p＜0.05）,其中114个表达上调，222个表达下调。LMCs不良组与健康对照组比较，共有721个lncRNA差异表达（差异倍数＞2， p＜0.05）,其中207个表达上调，而514个表达下调。LMCs不良组与LMCs良好组比较，共有179个lncRNA有差异表达（差异倍数＞2， p＜0.05），其中93个表达上调，86个表达下调。其中，有24个lncRNA在三组受试者外周血中均有表达，且在LMCs不良组与LMCs良好组间存在差异表达，同时在LMCs不良组与健康对照组间也存在差异表达。
2.我们通过Cis和Trans分析以进一步预测lncRNA的靶基因，结合芯片筛选得到的mRNA对其功能(GO)和通路(KEGG)进行分析，并根据差异倍数，进一步筛选出与侧支循环建立可能相关的7个lncRNA进行扩大样本量验证。验证组共纳入37名MCAO患者（其中50％为女性，平均年龄为66.2±13.5岁）；其中有软脑膜侧支循环不良14例患者（其中50％为女性，平均年龄为70.4±14.2岁），软脑膜侧支循环良好23例患者（其中47.8％为女性，平均年龄为63.6±12.6岁）。在同一时期，纳入19名正常人作为健康对照（其中52.6％为女性，平均年龄为 58.7±9.5 岁）。经初筛及验证，发现 lncRNA CUST_13453_PI430048170在LMCs不良组的表达较LMCs良好组以及健康对照组均显著下降。ROC曲线分析结果显示CUST_13453_PI430048170能够有效预测脑梗死后LMCs不良的发生（P=0.016），曲线下面积（Area under curve，AUC）为0.739（95％CI;0.576-0.903）。同时，通过Cis预测， CUST_13453_PI430048170的靶基因为配对核基因8（paired box, Pax8）。
第二部分
1.本研究共纳入96名急性M1 MCA+/-ICA闭塞患者（42.7％为女性，平均年龄为67.7±12.1岁）。根据rLMC评分，有51例患者（53.1％）评为软脑膜侧支循环不良（LMCs不良组），有45例（46.9％）患者评为软脑膜侧支循环良好（LMCs良好组）。在同一时期，共33名正常人被纳入健康对照组（60.6％为女性，平均年龄为62.8±10.6岁）。
在RGMa与脑梗死软脑膜侧支状态相关性分析中发现，急性脑梗死患者（LMCs不良组+LMCs良好组）外周血RGMa mRNA表达水平显著高于健康对照组（P＜0.001）。而在纳入的急性脑梗死患者中，LMCs不良组的RGMa mRNA表达水平显著高于LMCs良好组（p=0.001）以及健康对照组（p=0.002）；而RGMa水平在LMCs良好组与健康对照组间无显著性差异（p=1.000）。通过Spearman检验观察到RGMa mRNA的表达水平与LMCs状态之间呈显著负相关（r=-0.273, p=0.007）。采用多因素 Logistic 回归模型分析，发现 RGMa mRNA 水平（ OR 1.099[1.035-1.168]，p=0.002）和基线NIHSS评分（OR 1.091[1.003-1.186]， p=0.042），是脑梗死患者软脑膜侧支不良的独立预测因子。ROC曲线分析发现 RGMa 能够预测 LMCs 不良的发生（ AUC=0.719 [95％CI;0.614-0.823];P＜0.001）。
2.从临床预后来看，LMCs不良的患者预后更差：与LMCs良好的患者相比，LMCs不良的患者住院期间死亡率更高（p=0.004），良好预后的发生率更低（p＜0.001）。通过多因素Logistic回归模型分析发现，LMCs不良（OR 0.117 [0.031-0.444]，p=0.002），基线NIHSS评分（OR 0.893 [0.798-0.999] ， p = 0.048 ）和卒中部位（右侧）（ OR 0.188 [ 0.052-0.677]，p=0.011）是患者发生预后不良的独立预测因子。
第三部分
共回顾性分析23例年龄≥90岁的符合入组条件的患者。这23人中包括7名男性（30.4%）和16名女性（69.6%）（中位年龄，92岁；四分位间距，90-93岁）。其中9例只接受了静脉溶栓治疗（IVT组），有14例接受了机械取栓（ET组）。
在疗效方面，ET组患者早期神经功能恢复的比例远远高于IVT组，同时ET组患者获得良好预后（90天mRS≤2）的比例更高，但两组间差异无统计学意义。
而在接受血管再通治疗的超高龄患者中，ET的安全性较IVT更高。血管内治疗后的SICH发生率明显低于单用静脉溶栓治疗，且差异具有统计学意义。通过多因素分析发现，IVT（p=0.002）和女性（p=0.036）是SICH的独立预测因子。此外，在所有患者中，有17.4%的患者（4/23）在住院期间死亡，30.4%的患者（7/23）在发病3个月内死亡。但90天病死率在ET与IVT组间无显著性差异（P=0.809）。
结论：
1.外周血中lncRNA CUST_13453_PI430048170表达下调与脑梗死后软脑膜侧支不良相关，其可能成为预测急性MCAO脑梗死患者软脑膜侧支不良的生物学指标。此外，该lncRNA可能通过它的靶基因PAX8而参与到脑梗死后软脑膜侧支的调控中。我们将进一步通过动物和细胞实验，探索lncRNA CUST_13453_PI430048170与软脑膜侧支循环建立的关系及相关机制。
2.RGMa mRNA在急性脑梗死患者的外周血PBMCs中表达升高；而在急性脑梗死患者中，外周血RGMa mRNA表达水平在LMCs不良组显著增高。患者外周血RGMa mRNA表达水平上调与脑梗死软脑膜侧支不良相关，提示RGMa有可能成为预测脑梗死后LMCs不良的生物学指标，且RGMa有可能对脑梗死软脑膜侧支循环起负调控作用。但RGMa调控软脑膜侧支的具体机制尚需要进一步通过动物及细胞实验进行验证。
3.外周血中RGMa mRNA水平和基线NIHSS评分是脑梗死后软脑膜侧支不良的独立预测因子；而LMCs不良，基线NIHSS评分和卒中部位（右侧）是MCAO患者发生预后不良的独立预测因子。
4.经多模式MRI的序列DWI/FLAIR（FVH）不匹配筛选，对于侧支循环良好的超高龄（年龄≥90岁）且合并由急性前循环大血管闭塞所致的脑梗死患者，给予新一代可回收支架为主的机械取栓治疗是安全的，并且可以提高患者获得早期神经恢复以及90天良好预后的比例。基于急性脑缺血病理生理影像的多模式MRI序列DWI/FLAIR（FVH）不匹配指导下的MCAO的血管内治疗是安全的，可用于识别最有可能受益于ET治疗的超高龄患者。
急性缺血性脑卒中因高发病率、高致残率和高死亡率，已成为一个全球化健康问题。而其中，大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）的发生率又远高于其他脑动脉闭塞；因此，MCAO在缺血性脑卒中占有非常重要的地位。MCAO患者的临床表现各异，有的梗死体积小，经治疗后可无遗留的神经功能缺损；而有的梗死体积大，甚至最终因梗死体积进一步扩大而导致死亡；而影响卒中梗死体积、临床严重程度以及预后的重要因素之一正是软脑膜侧支循环的建立。
侧支是指存在于大多数组织中的连接相邻树状动脉群的动脉结构，可通过改变血流通路而向闭塞血管的供血区提供逆向血流灌注。根据侧支循环的代偿层次，人类脑侧支循环可分为三级。其中，作为二级侧支循环的软脑膜侧支是存在于大脑皮层表面的血管网络，可连接双侧大脑前动脉、大脑前动脉与大脑中动脉、大脑前动脉与大脑后动脉、大脑中动脉与大脑后动脉的末端。当大脑中动脉近端闭塞时，作为一级侧支的Willis环不再能提供有效的侧支血供，而次级侧支——软脑膜侧支则为缺血半暗带提供关键营养支持，起到维持脑血流量并且减少脑梗死体积的作用。大量的临床研究表明，具有良好软脑膜侧支的MCAO患者其梗死体积更小，神经功能缺损更轻，临床预后更好。此外，针对血管再通治疗的研究发现，软脑膜侧支良好的患者对血管内治疗的反应更好，出现症状性颅内出血的风险更低，神经功能恢复更好；而即使在再灌注不理想或未达到完全的血管再通的情况下，良好的侧支循环仍可通过促进脑血流灌注，而起到有效抑制缺血半暗带向梗死进展的作用。因此，准确而及时地评估MCAO患者软脑膜侧支状态（leptomeningeal collateral status, LMCs），无论对于患者的个体化治疗方案的确定还是对其临床预后的判断都极为重要。
目前，判断脑梗死后软脑膜侧支循环方法主要以影像学评估为主。虽然数字减影血管造影（digital subtraction angiography，DSA）是评价各级侧支的金标准，但在无条件或不适合进行该检查的情况下，CT血管成像技术（CT angiography，CTA）可作为评估软脑膜侧支状态的首选。然而，基于CTA的LMCs的评估并不能直接观察到这些小的动脉间连接，而是依赖于通过这些侧支血管接收血流的动脉灌注的程度和速率而间接评估软脑膜侧支状态。同时，完成影像学检查需要一定的时间和患者的配合度，上述因素以及检查者的熟练程度都将不同程度地影响成像结果，从而影响评估结果。由此看出，仅从影像学评估而确定患者软脑膜侧支代偿能力存在一定缺陷，特别是对于在血管内治疗时间窗内的患者，及早地评估软脑膜侧支代偿程度对于患者治疗方案的选择至关重要。因此，我们需要寻找其他方法，以提高评估软脑膜侧支状态的准确性和全面性。由此可见，探索软脑膜侧支相关因子，寻找脑梗死软脑膜侧支循环的预测和治疗靶点，从而对急性大脑中动脉闭塞性脑梗死进行有针对性的个体化治疗和预防，已成为急性脑梗死研究的新方向，具有重要的临床意义。
研究表明，软脑膜侧支于胚胎期开始形成。基因调控及环境因素，对这一过程产生着举足轻重的影响，并最终导致软脑膜侧支状态差异的形成。而这其中，基因调控是决定脑梗死后软脑膜侧支状态的至关重要的因素。那么，在影响缺血性卒中患者侧支循环的庞大基因调控网络机制中，如何找到一个在侧支循环形成与开放中起到至关重要作用的角色，能起到“牵一发而动全身”效应的靶点呢？因此，本研究中，我们首先通过基因芯片（microarray）以及实时定量聚合酶链式反应（quantitative real time polymerase chain reaction，RT-PCR）等技术，探索在人类发生急性脑梗死后，与软脑膜侧支建立相关的基因。
我们首先采用了基于CTA的区域软脑膜侧支循环评分（Regional leptomeningeal collateral，rLMC）评分系统，以评估MCAO患者的LMCs状态。我们根据rLMC评分，将急性脑梗死患者分为软脑膜侧支不良（rLMC评分≤10分；LMCs不良组）和软脑膜侧支良好组（rLMC评分＞10分；LMCs良好组）；同时也纳入无脑梗死的健康对照组。我们通过基因芯片技术，检测LMCs不良组、LMCs良好组以及健康对照组人外周血中长链非编码RNA（long non-coding RNA, lncRNA）的表达谱（共91007个lncRNA探针），进行差异表达lncRNA筛选，并进一步通过RT-PCR技术对差异表达的lncRNA进行验证，以期发现与脑梗死后软脑膜侧支状态相关的lncRNA。
另外，本研究中所使用的lncRNA基因芯片中还包含了29857个信使RNA（message RNA, mRNA）探针。而在前期的基因芯片筛查中我们意外地发现，排斥性导向分子a（repulsive guidance molecule, RGMa）的mRNA在LMCs不良组中有表达上调趋势。有趣的是，我们团队在前期的研究中发现， RGMa在小鼠缺血性脑卒中的血管新生过程（angiogenesis）中发挥负性调控作用；而体外实验也发现，RGMa对血管内皮细胞的增殖、迁移和小管形成均有显著的抑制作用；这些发现表明RGMa在血管形成中起重要作用并且可以导致内皮细胞功能障碍。另有研究表明，内皮细胞功能障碍会导致小鼠软脑膜侧支建立受损。由此，我们大胆推测RGMa可能与脑梗死患者软脑膜侧支状态相关。因此，我们再次通过RT-PCR技术，检测LMCs不良组、LMCs良好组以及健康对照组人外周血中RGMa的mRNA表达，以验证在人类脑梗死后RGMa与软脑膜侧支状态的关系。
除基因调控外，环境因素也与软脑膜侧支状态密切相关。相关研究发现：高龄、代谢综合征、高尿酸血症等危险因素会使血管调节能力和内皮功能下降，从而导致二级软脑膜侧支代偿能力下降。因此，在以往的临床研究中，高龄患者行血管再通治疗通常被认为是风险高于获益的：与年轻患者相比，超高龄患者在接受机械取栓（endovascular thrombectomy，ET）治疗后90天不良结局的风险要高得多。随着人类预期寿命的延长，这类高龄人群中MCAO的患者数量已显著增加。在我们的临床工作及研究过程中，我们也发现了越来越多的高龄（年龄≥80岁）、甚至是超高龄（年龄≥90岁）的MCAO患者。目前的大型临床试验中已观察到对于合并MCAO的急性脑梗死，经影像学筛选具有缺血半暗带的患者行机械取栓（ET），其预后要远远优于单纯行静脉溶栓（intravenous thrombolysis，IVT）的患者。而既往针对老年患者的临床研究却一般仅单纯采用“时间窗”概念来筛选患者，并没有采用基于“组织窗”的影像学评估来筛选符合血管再通治疗条件的超高龄患者。那么，在老年患者尤其是超高龄患者中经影像学筛选后行ET的疗效及安全性又如何呢？
研究发现，在各种影像学筛选方法中，与CT灌注扫描检查相比，尽管使用MRI筛选行ET的患者从发病至治疗的时间可能有所延迟，但最终的预后与影像学结果比较差异无统计学意义。其中，基于急性脑缺血病理生理影像的多模式核磁共振（magnetic resonance imaging， MRI）序列的磁共振弥散加权成像（Diffusion-weighted MR imaging， DWI ）/磁共振液体衰减反转恢复序列（ Fluid-attenuated inversion recovery imaging，FLAIR）不匹配可评估核心梗死和缺血半暗带，而FLAIR 序列中的液体衰减反转恢复血管高信号征（ Flair vascular hyperintensity，FVH）反映了软脑膜侧支循环形成及潜在可拯救的脑组织，大脑外侧裂的FVH可作为MCAO患者侧支循环的独立预测指标；因此，DWI/FLAIR（FVH）不匹配实际是对急性脑梗死患者进行病理生理组织窗及软脑膜侧支状态的综合评估；DWI/FLAIR（FVH）可识别最有可能受益于血管再通的超高龄患者，其指导下的MCAO患者的再灌注治疗更加安全、有效。因此，在本次的临床研究中，我们也将对经DWI/FLAIR（FVH）不匹配筛选的超高龄患者行ET治疗的疗效及安全性进行探讨，以期为我们今后的临床工作提供更多参考。
方法：
第一部分
前瞻性纳入合并大脑中动脉M1段＋/-颈内动脉（intracranial carotid artery，ICA）闭塞的超急性期脑梗死患者：所有患者从首次发现症状至到达医院的时间均小于24小时；并在同时期纳入无脑梗死的健康对照组。所有脑梗死患者入院后立即完善头颅CT平扫及头颈部CTA检查，并通过rLMC评分系统评价软脑膜侧支开放程度。根据软脑膜侧支状态，将脑梗死患者分为：软脑膜侧支循环不良（rLMC评分≤10分；LMCs不良组）和软脑膜侧支循环良好组（rLMC评分＞10分；LMCs良好组）。使用外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells， PBMCs）作为lncRNA的来源，通过lncRNA基因芯片（SBC Human [4*180K] lncRNA）技术，分析三组受试者外周血中lncRNA的基因表达谱；并对发现有差异表达的lncRNA进行扩大样本量验证，以探索与脑梗死患者软脑膜侧支不良相关的lncRNA。采用接收者工作特征曲线（Receiver operating characteristic，ROC）检验lncRNA预测脑梗死患者软脑膜侧支不良的能力，并最终通过Cis和Trans分析进一步预测lncRNA的靶基因。
第二部分
1.前瞻性纳入合并大脑中动脉M1段＋/-颈内动脉闭塞的超急性期脑梗死患者（所有患者从首次发现症状至到达医院的时间均小于24小时）。在同一时期，纳入无脑梗死的健康对照组。所有脑梗死患者入院后立即完善头颅CT平扫及头颈部CTA检查，并通过rLMC评分系统评价软脑膜侧支的开放程度。根据软脑膜侧支状态，将脑梗死患者分为：软脑膜侧支不良（rLMC评分≤10分；LMCs不良组）和软脑膜侧支良好组（rLMC评分＞10分；LMCs良好组）。我们通过RT-PCR技术，检测各组受试者PBMCs中RGMa mRNA表达。采取单变量分析检验LMCs不良组、LMCs良好组及健康对照组间临床资料及RGMa mRNA表达水平的差异；通过多元Logistic回归模型，分析脑梗死患者发生LMCs不良的独立预测因子；采用Spearman检验RGMa mRNA水平与LMCs状态的相关性；通过ROC曲线以检验RGMa预测脑梗死患者软脑膜侧支不良的灵敏度和特异性。通过上述方法，探索在MCAO患者中，RGMa与脑梗死LMCs状态的相关性。
2.根据90天改良Rankin评分（modified Rankin scale，mRS），进一步将患者分为：预后良好组（90天mRS≤2）和预后不良组（90天mRS＞2）。采取单变量分析以及多元Logistic回归模型，探讨脑梗死患者发生良好预后的独立预测因子。
第三部分
纳入符合以下入选标准的患者，进行回顾性分析：1）年龄≥90岁；2）颈内动脉和/或大脑中动脉M1和/或M2段闭塞所引起的急性脑梗死；3）MRI显示DWI/FLAIR（FVH）不匹配（DWI上表现为高信号，而在相应的T2加权FLAIR图像上未见明显异常信号，且大脑外侧裂存在点状、线状或管状的FLAIR高强度信号）；4）发病24小时内接受了血管再通治疗。根据血管再通治疗方案，将患者分为IVT组（只接受静脉溶栓）和ET组（接受了机械取栓或桥接治疗）。主要预后指标包括早期神经功能改善、90天mRS评分（mRS≤2定义为临床预后良好）、住院期间及 90 天死亡率，以及治疗后症状性颅内出血（symptomatic intracranial hemorrhage，SICH）发生率。采取单变量分析检验比较两组间临床资料及预后的差异，采用多元Logistic回归模型寻找超高龄患者发生SICH的独立预测因子。
结果
第一部分
1.首先纳入3名无脑梗死正常人（健康对照组）、3名软脑膜侧支良好患者（LMCs良好组）以及3名软脑膜侧支不良患者（LMCs不良组）进行lncRNA基因芯片分析。基因芯片结果显示，在外周血中， LMCs良好组与健康对照组比较，共336个lncRNA存在差异表达（差异倍数＞2，p＜0.05）,其中114个表达上调，222个表达下调。LMCs不良组与健康对照组比较，共有721个lncRNA差异表达（差异倍数＞2， p＜0.05）,其中207个表达上调，而514个表达下调。LMCs不良组与LMCs良好组比较，共有179个lncRNA有差异表达（差异倍数＞2， p＜0.05），其中93个表达上调，86个表达下调。其中，有24个lncRNA在三组受试者外周血中均有表达，且在LMCs不良组与LMCs良好组间存在差异表达，同时在LMCs不良组与健康对照组间也存在差异表达。
2.我们通过Cis和Trans分析以进一步预测lncRNA的靶基因，结合芯片筛选得到的mRNA对其功能(GO)和通路(KEGG)进行分析，并根据差异倍数，进一步筛选出与侧支循环建立可能相关的7个lncRNA进行扩大样本量验证。验证组共纳入37名MCAO患者（其中50％为女性，平均年龄为66.2±13.5岁）；其中有软脑膜侧支循环不良14例患者（其中50％为女性，平均年龄为70.4±14.2岁），软脑膜侧支循环良好23例患者（其中47.8％为女性，平均年龄为63.6±12.6岁）。在同一时期，纳入19名正常人作为健康对照（其中52.6％为女性，平均年龄为 58.7±9.5 岁）。经初筛及验证，发现 lncRNA CUST_13453_PI430048170在LMCs不良组的表达较LMCs良好组以及健康对照组均显著下降。ROC曲线分析结果显示CUST_13453_PI430048170能够有效预测脑梗死后LMCs不良的发生（P=0.016），曲线下面积（Area under curve，AUC）为0.739（95％CI;0.576-0.903）。同时，通过Cis预测， CUST_13453_PI430048170的靶基因为配对核基因8（paired box, Pax8）。
第二部分
1.本研究共纳入96名急性M1 MCA+/-ICA闭塞患者（42.7％为女性，平均年龄为67.7±12.1岁）。根据rLMC评分，有51例患者（53.1％）评为软脑膜侧支循环不良（LMCs不良组），有45例（46.9％）患者评为软脑膜侧支循环良好（LMCs良好组）。在同一时期，共33名正常人被纳入健康对照组（60.6％为女性，平均年龄为62.8±10.6岁）。
在RGMa与脑梗死软脑膜侧支状态相关性分析中发现，急性脑梗死患者（LMCs不良组+LMCs良好组）外周血RGMa mRNA表达水平显著高于健康对照组（P＜0.001）。而在纳入的急性脑梗死患者中，LMCs不良组的RGMa mRNA表达水平显著高于LMCs良好组（p=0.001）以及健康对照组（p=0.002）；而RGMa水平在LMCs良好组与健康对照组间无显著性差异（p=1.000）。通过Spearman检验观察到RGMa mRNA的表达水平与LMCs状态之间呈显著负相关（r=-0.273, p=0.007）。采用多因素 Logistic 回归模型分析，发现 RGMa mRNA 水平（ OR 1.099[1.035-1.168]，p=0.002）和基线NIHSS评分（OR 1.091[1.003-1.186]， p=0.042），是脑梗死患者软脑膜侧支不良的独立预测因子。ROC曲线分析发现 RGMa 能够预测 LMCs 不良的发生（ AUC=0.719 [95％CI;0.614-0.823];P＜0.001）。
2.从临床预后来看，LMCs不良的患者预后更差：与LMCs良好的患者相比，LMCs不良的患者住院期间死亡率更高（p=0.004），良好预后的发生率更低（p＜0.001）。通过多因素Logistic回归模型分析发现，LMCs不良（OR 0.117 [0.031-0.444]，p=0.002），基线NIHSS评分（OR 0.893 [0.798-0.999] ， p = 0.048 ）和卒中部位（右侧）（ OR 0.188 [ 0.052-0.677]，p=0.011）是患者发生预后不良的独立预测因子。
第三部分
共回顾性分析23例年龄≥90岁的符合入组条件的患者。这23人中包括7名男性（30.4%）和16名女性（69.6%）（中位年龄，92岁；四分位间距，90-93岁）。其中9例只接受了静脉溶栓治疗（IVT组），有14例接受了机械取栓（ET组）。
在疗效方面，ET组患者早期神经功能恢复的比例远远高于IVT组，同时ET组患者获得良好预后（90天mRS≤2）的比例更高，但两组间差异无统计学意义。
而在接受血管再通治疗的超高龄患者中，ET的安全性较IVT更高。血管内治疗后的SICH发生率明显低于单用静脉溶栓治疗，且差异具有统计学意义。通过多因素分析发现，IVT（p=0.002）和女性（p=0.036）是SICH的独立预测因子。此外，在所有患者中，有17.4%的患者（4/23）在住院期间死亡，30.4%的患者（7/23）在发病3个月内死亡。但90天病死率在ET与IVT组间无显著性差异（P=0.809）。
结论：
1.外周血中lncRNA CUST_13453_PI430048170表达下调与脑梗死后软脑膜侧支不良相关，其可能成为预测急性MCAO脑梗死患者软脑膜侧支不良的生物学指标。此外，该lncRNA可能通过它的靶基因PAX8而参与到脑梗死后软脑膜侧支的调控中。我们将进一步通过动物和细胞实验，探索lncRNA CUST_13453_PI430048170与软脑膜侧支循环建立的关系及相关机制。
2.RGMa mRNA在急性脑梗死患者的外周血PBMCs中表达升高；而在急性脑梗死患者中，外周血RGMa mRNA表达水平在LMCs不良组显著增高。患者外周血RGMa mRNA表达水平上调与脑梗死软脑膜侧支不良相关，提示RGMa有可能成为预测脑梗死后LMCs不良的生物学指标，且RGMa有可能对脑梗死软脑膜侧支循环起负调控作用。但RGMa调控软脑膜侧支的具体机制尚需要进一步通过动物及细胞实验进行验证。
3.外周血中RGMa mRNA水平和基线NIHSS评分是脑梗死后软脑膜侧支不良的独立预测因子；而LMCs不良，基线NIHSS评分和卒中部位（右侧）是MCAO患者发生预后不良的独立预测因子。
4.经多模式MRI的序列DWI/FLAIR（FVH）不匹配筛选，对于侧支循环良好的超高龄（年龄≥90岁）且合并由急性前循环大血管闭塞所致的脑梗死患者，给予新一代可回收支架为主的机械取栓治疗是安全的，并且可以提高患者获得早期神经恢复以及90天良好预后的比例。基于急性脑缺血病理生理影像的多模式MRI序列DWI/FLAIR（FVH）不匹配指导下的MCAO的血管内治疗是安全的，可用于识别最有可能受益于ET治疗的超高龄患者。