论文部分内容阅读
背景：在DNA甲基化研究中,重亚硫酸盐处理DNA是一种应用广泛的实验方法。重亚硫酸盐能将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶。重亚硫酸盐处理DNA的转化效率决定了DNA甲基化检测的准确性,未完全转化的DNA会在后续的分析中导致假阳性结果。因此,评估重亚硫酸盐转化DNA的效率以提高甲基化研究的准确性是非常必要的。本研究提出一种简单可行的检测方法,通过Real time PCR评估重亚硫酸盐转化DNA的效率。目的：建立一种评估重亚硫酸盐处理DNA样本后胞嘧啶转化效率的有效方法,快速、方便和准确地检测DNA样本经重亚硫酸盐转化的效率。方法：以两组不同的TaqMan Real time PCR检测重亚硫酸盐处理的和未处理的DNA序列,分别建立转化与未转化的β-Actin启动子上游参照序列DNA的Ct值以及对应的DNA拷贝数的标准曲线,再使用相同探针检测人源的DNA经重亚硫酸盐转化后的样本。使用公式：转化率%=转化的DNA拷贝数／(转化DNA拷贝数+未转化的DNA拷贝数)x 100%。设计与已知物种无同源性的序列作为参照序列,将该序列作为参照加入待处理DNA样本中,使用SYBR Green Real time PCR方法评估广泛物种的DNA经重亚硫酸盐转化的效率。结果：建立转化与未转化的DNA标准曲线,分别使用不同探针和引物检测处理后的DNA样本,并使用已知的DNA样本评估该3-Actin启动子上游序列评估该方法的可靠性;同时检测了以无物种同源性的序列作为参照序列的可靠性,使该方法具有更广泛的应用价值。结论：该方法能够有效的评估任何物种来源的DNA样品重亚硫酸盐的转化率,为提高DNA甲基化分析准确性提供有效方法。