牛无浆体病套式PCR及实时荧光PCR检测方法的建立

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无浆体病(Anaplasmosis)主要由边缘无浆体(Anaplasma marginale)感染引起。中央无浆体(A.centrale)只引起轻微的无浆体病。绵羊无浆体(A.ovis)主要感染绵羊,但也感染山羊和其它一些野生动物。检测无浆体的PCR方法有多种,但是到目前为止,并未有一种可以检测和鉴别三种无浆体的PCR方法。根据无浆体msp4基因设计的套式PCR方法,扩增无浆体的片段长度为716bp,边缘无浆体的片段长度为431bp,中央无浆体的片段长度为310bp,绵羊无浆体的片段长度为584bp。该方法检测的最低DNA量为200fg。Msp4套式PCR对牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫、羊莫氏巴贝斯虫、山羊泰勒虫、温氏附红细胞体、东方巴贝斯虫、刚地弓形虫、伊氏锥虫DNA进行检测,无目的片段出现。检测1119份临床样品,阳性率为9.4%。用建立的msp4套式PCR与msp5套式PCR比较,结果表明两者的符合率为100%。自然感染条件下,三种无浆体可两两交叉感染。根据无浆体msp4的保守基因序列设计特异引物AMOC9/AMOC5,AMOC10/AMOC12和特异性探针MP,首次建立了牛边缘无浆体的实时荧光PCR检测方法,在特异性与敏感性方面,与建立的msp4套式PCR的符合率为100%。用建立的方法检测采自江苏、哈尔滨180份奶牛和肉牛抗凝血,阳性率为8.9%。结果表明,建立的实时荧光PCR检测牛边缘无浆体的方法具有较高的特异性和敏感性,可用于牛边缘无浆体病的流行病学调查、检疫和监测。
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