背景与目的在全球范围内,肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是最常见的恶性肿瘤类型之一,也是癌症相关死亡的第三大原因。经肝动脉化疗栓塞（Transcatheter hepatic arterial chemoembolization,TACE）主要用于治疗中晚期HCC,也可在手术前运用从而使肿瘤缩小,或是用于不需要根治性切除的补充治疗。目前评估TACE疗效和预后的手段非常有限,因此我们需要寻找一个与TACE疗效相关的分子标记物用于评估临床治疗效果。近年来越来越多的非编码RNA（Non-coding RNA,ncRNA）通过高通量测序技术（high-throughput sequencing）被发现,主要包括长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）、微小RNA（micro RNA,miRNA）和环状RNA（circular RNA,circRNA）,这部分非编码RNA在肿瘤的发生以及进展过程中发挥着不同的调控作用。环状RNA（circular RNA,circRNA）是一类内源性非编码RNA（ncRNA）,其共价闭合环结构具有相对较高的稳定性、保守性以及组织特异性表达的特点。因此,在全血、血浆和血小板中circRNA的表达高于线性m RNA、miRNA和其他类型的RNA。一些环状RNA在肝癌细胞中存在差异表达,这些环状RNA与肝脏疾病中细胞的增殖、侵袭、迁移、血管生成、凋亡和转移有关,并作为致癌因子或抑制因子,与临床表现相关。目前很多研究表明,其作为肝脏疾病尤其是HCC的生物标志物或治疗靶点有着重要的研究价值。随着相关研究不断深入,越来越多的circRNA被当作HCC潜在的诊断和预后标志物。长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）是一类不具有蛋白质编码功能的RNA,其长度大于200个核苷酸序列。近年来大量研究发现,许多lncRNAs具有潜在的竞争性内源RNA（competing endogenous RNA,ce RNA）特性,这一类lncRNA通过分子海绵的方式竞争性吸附miRNA,进一步调控下游靶基因的表达,通过lncRNA-miRNA-m RNA调节轴参与调控肿瘤的多种生物学行为,在肿瘤的发生和进展中不仅能发挥促癌作用,还能抑制肿瘤的进展。越来越多的证据证实,外泌体环状RNA（circRNAs）、长链非编码RNA（lncRNAs）在肝细胞癌的预后预测和诊断中起着至关重要的作用。本研究目的在于探讨经动脉化疗栓塞术（TACE）过程中外泌体circRNAs、lncRNAs的表达模式,及它们在肝癌发生与发展及演变过程中的作用及相关分子机制,寻找TACE相关疗效、预后指标的分子标志物。为肝癌诊断、治疗尤其是TACE治疗的疗效评判以及预后提供新的理论基础和实验依据。研究方法1.收集2017年5月至2019年5月期间成都医学院第一附属医院的5名HCC患者的肝动脉血液,采集的三个时间点为:TACE术前、第一次TACE手术后、第二次TACE手术后。2.进行高通量全转录组测序,用DCC软件对血清外泌体circRNAs、lncRNAs进行检测和鉴定,并用circ Base、lnc Base数据库进行注释。用edge R软件对数据进行归一化处理,并对差异表达的circRNAs、lncRNAs进行分析。3.通过高通量全转录组测序和随后的生物信息学分析对circRNA、lncRNA测序分析。通过GO（http://www.http://geneontology.org）和KEGG通路分析（KEGG;http://www.genome.jp/kegg）,对差异表达的circRNAs、lncRNAs进行注释并确定其功能。4.在体内外实验中证实circ G004213/miR513b5p/PRPF39在Hep G2对顺铂敏感性中的作用与机制。并在50例HCC患者中进一步分析circ G004213与患者预后的相关性。5.统计分析:所有的统计分析使用SPSS 20.0（IBM公司）进行。使用Medcalc v18.9（Medcalc Software Bvba）软件计算样本量,以确保足以检测预先规定的效应量。为确定显著性差异,组间比较采用Student’s t-检验,多组间比较采用单因素方差分析,每个实验至少重复了三次。Kaplan-Meier曲线生存分析采用log-rank检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。结果第一部分:TACE治疗过程中,血清外泌circRNAs的变化与功能研究。1.通过血清外泌体全转录组测序,在TACE术前组和TACE1组之间鉴定出390个差异表达的circRNAs（倍数变化≥2.0;P＜0.05）。得到了305个显著上调和85个显著下调的circRNAs。而TACE术前组和TACE2组相比,得到了489个差异表达的circRNAs,其中422个上调和67个下调。2.通过对TACE治疗过程中差异circRNAs进行GO分析,发现差异circRNAs与雄激素受体负调控,B细胞负调控,超长链脂肪酸-Co A连接酶,胰岛素受体底物结合,中链脂肪酸代谢、激酶活性和水通道活性相关。3.通过对差异circRNAs进行KEGG分析,发现差异circRNAs与蛋白质消化和吸收途径、造血细胞谱系、鞘脂信号与磷脂酰肌醇信号通路相关。4.circRNA-G004213通过增加顺铂敏感性改善Hep G2荷瘤小鼠的预后。5.circRNA-G004213通过miR-513b-5p/PRPF39调控顺铂的敏感性。6.circ-G004213与HCC患者TACE术后预后呈正相关。第二部分:TACE治疗过程中,血清外泌lncRNAs的变化研究。1.通过血清外泌体全转录组测序,在TACE术前组和TACE1组之间鉴定出1728个差异表达的lncRNAs。其中1400个lncRNAs显著上调,328个显著下调。而TACE术前组和TACE2组相比,得到了697个差异表达的lncRNAs,其中420个上调和277个下调。2.通过对TACE治疗过程中差异lncRNAs进行GO分析,发现差异lncRNAs与神经系统的发育、伴侣介导的自噬、细胞器、细胞分泌体相关及转录阻遏物活性有关。3.通过对差异lncRNAs进行KEGG分析,发现差异lncRNAs与癌症中的转录调控失调,抗原的呈递及处理,胰岛素抵抗等信号通路相关。结论1.通过对TACE治疗过程中变化的circRNAs的研究筛选出circ-G004213在TACE后显著上调,并进一步证实circ-G004213显著提高了Hep G2细胞对顺铂的敏感性,与荷瘤小鼠的预后呈正相关。基于潜在的下游miRNA和m RNA,构建了circRNA-miRNA-m RNA网络。结果表明,circ-G004213通过miR-513b-5p/PRPF39轴调控顺铂耐药。最后,本研究证实circ-G004213与HCC患者TACE术后预后呈正相关。因此,circ-G004213可作为预测TACE疗效的一项指标。2.在TACE治疗过程中,我们鉴定出43个稳定上调的lncRNAs,并发现了37个稳定下调的lncRNAs。进一步分析发现差异lncRNAs与神经系统的发育、细胞分泌体相关。同时与癌症中的转录调控失调,抗原的呈递及处理等信号通路相关。