雷竹PvPin1At基因克隆和功能分析

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Pin1(peptidyl-prolyl cis/trans isomerase,PPIase)是肽基脯氨酰顺反异构酶。Pin1对植物成花转变和人类癌症等疾病具有调控作用。在对拟南芥Pin1同源基因Pin1At研究中发现,Pin1At基因具有调控开花时间的作用。拟南芥中Pin1At蛋白是通过促进SOC1和AGL24两个MADS-domain转录因子中磷酸化的Ser/Thr-Pro基团顺反异构来调控成花转变,从而调控植物开花时间。本实验希望通过对雷竹(Phyllostachys violascens)Pin1At同源基因的克隆和功能分析,进一步了解竹类植物开花机理,为竹类植物开花研究奠定理论和实践基础。实验根据玉米、水稻、以及雷竹转录组数据库设计引物,以雷竹(Phyllostachysviolascens)为材料,利用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNAends, RACE),获得PvPin1At cDNA全长756bp序列。用高保真酶扩增雷竹PvPin1At ORF区,得到2条PvPin1At序列,命名为PvPin1At1和PvPin1At2,它们的开放阅读框都为369bp,编码122个氨基酸。其中,PvPin1At1第59个氨基酸为丝氨酸,PvPin1At2在第59个氨基酸为甘氨酸。对PvPin1At基因分析和研究,得出以下结果:(1)通过序列比对发现PvPin1At基因在植物中相当保守,系统进化树分析表明PvPin1At基因与禾本科植物二穗短柄草、水稻等聚为一类。(2)对处在开花期雷竹做荧光定量PCR分析,发现该基因在嫩叶中表达量最高,其次是茎和鞭,在花芽、老叶、笋中表达量低。对不同时期的雷竹(开花前四周到开花),做荧光定量PCR分析,发现PvPin1At基因在开花前表达量逐渐升高,当达到一定阈值后表达量逐渐下降。(3)通过酵母双杂交实验,证明雷竹中PvPin1At蛋白与PvSOC1蛋白不能相互作用。(4)PvPin1At基因转入拟南芥功能验证发现,35S::PvPin1At1转基因拟南芥比野生型拟南芥早开花6-7d,而35S::PvPin1At2转基因拟南芥与野生型拟南芥表型差异不明显,说明PvPin1At1基因中的第59位丝氨酸可能对雷竹开花调控有重要作用。(5)为了研究PvPin1At蛋白的晶体结构,我们构建了原核表达载体,获得可溶目的大小为31kDa左右的PvPin1At蛋白。(6)因为人类Pin1基因的第71号丝氨酸突变为天冬氨酸后,会造成功能缺失,所以我们对雷竹PvPin1At相应位点的27位丝氨酸突变为天冬氨酸,构建了该位点突变的植物双元表达载体,通过转入拟南芥突变体,证明其功能是否有缺失。(7)PvPin1At1转入水稻中,目前已获得T1代水稻40株,通过DNA检测证明PvPin1At1已经成功转入水稻中。
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