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目的探究p53依赖途径是否参与调控微囊藻毒素-LR诱导SD大鼠睾丸支持-生精共培养细胞凋亡过程,线粒体在发生凋亡过程中又发挥怎样的作用?通过检测细胞凋亡率、细胞中线粒体膜电位、p53依赖途径凋亡相关蛋白及线粒体外膜蛋白VDAC1等,验证p53依赖途径及线粒体在微囊藻毒素-LR诱发SD大鼠睾丸支持-生精共培养细胞凋亡过程中的作用,为微囊藻毒素-LR诱导的生殖毒性提供新的分子机制和理论基础。方法1.原代睾丸支持-生精共培养细胞提取和培养:选取22天SD雄鼠,分离睾丸,提取睾丸支持-生精细胞,建立睾丸支持-生精共培养细胞体系。2.细胞增殖抑制率检测:不同浓度MC-LR（0,1,5,10,20,40,60μg/mL）染毒睾丸支持-生精共培养细胞24 h后,采用CCK-8试剂盒测定各浓度组细胞增殖抑制情况,并计算出MC-LR作用于睾丸支持-生精共培养细胞24 h半数抑制浓度IC50,选取实验所用浓度为IC50、1/2IC50及1/4IC50。3.细胞凋亡率测定:采用AnnexinV-FITC/PI染色法和流式细胞术检测各浓度MC-LR组及MC-LR+相应抑制剂（PFT-α和CsA）组睾丸支持-生精共培养细胞凋亡率变化。4.细胞线粒体膜电位检测:各浓度MC-LR组及MC-LR+相应抑制剂（PFT-α和CsA）组染毒睾丸支持-生精共培养细胞24 h后,JC-1法结合流式细胞仪测定各组细胞线粒体膜电位有何变化。5.分离提取细胞中线粒体:各浓度MC-LR组及MC-LR+相应抑制剂（PFT-α和CsA）组作用睾丸支持-生精共培养细胞24 h后,采用线粒体分离试剂盒分离睾丸支持-生精共培养细胞中线粒体,用于下一步提取线粒体和细胞浆蛋白。6.凋亡相关蛋白检测:Western blotting法检测各浓度MC-LR组及MC-LR+相应抑制剂（PFT-α和CsA）组睾丸支持-生精共培养细胞中p53、PUMA、p21、MDM2及Cytc等蛋白相对表达水平。7.VDAC1 mRNA水平测定:采用Real time-PCR检测各浓度MC-LR组及MC-LR+CsA组睾丸支持-生精共培养细胞中VDAC1在mRNA水平相对表达量。结果1.MC-LR染毒睾丸支持-生精共培养细胞24 h后,除1μg/mL浓度组,MC-LR均能抑制睾丸支持-生精共培养细胞增殖。MC-LR浓度越大,对睾丸支持-生精共培养细胞增殖越明显,与对照组相比,差异具有显著性（P<0.05）。经计算,MC-LR作用于睾丸支持-生精共培养细胞IC50为36μg/mL,所选实验浓度分别为36μg/mL、18μg/mL和9μg/mL。2.不同浓度MC-LR（0,9,18,36μg/mL）作用睾丸支持-生精共培养细胞24h后,均可诱导睾丸支持-生精共培养细胞出现凋亡,与对照组相比,差异具有统计学意义（P<0.05）。MC-LR浓度越大,细胞凋亡率越高。在36μg/mL浓度组预先2 h进行PFT-α或CsA处理后,细胞凋亡率与单独36μg/mL MC-LR组相比,有明显降低,差异具有显著性（P<0.05）。3.不同浓度MC-LR（0,9,18,36μg/mL）染毒睾丸支持-生精共培养细胞24h后,与对照组相比,可明显降低细胞线粒体膜电位水平（P<0.05）,随MC-LR浓度增加,线粒体膜电位下降越明显。在36μg/mL浓度组提前2 h进行PFT-α或CsA预处理后,细胞线粒体膜电位水平与单独36μg/mL MC-LR组相比,有明显升高,差异具有显著性（P<0.05）。4.不同浓度MC-LR（0,9,18,36μg/mL）作用睾丸支持-生精共培养细胞24h后,可显著促进p53依赖途径促凋亡蛋白p53、PUMA、P21、clevead PARP及clevead caspase-3相对表达水平,降低MDM2蛋白表达水平,与对照组相比,差异具有显著性（P<0.05）。在36μg/mL浓度组提前2 h进行PFT-α预处理,与单独36μg/mL MC-LR组相比,可明显抑制p53、PUMA、P21、clevead PARP及clevead caspase-3的蛋白相对表达,同时抑制Cytc从线粒体释放到细胞质。5.不同浓度MC-LR（0,9,18,36μg/mL）染毒睾丸支持-生精共培养细胞24h后,可明显上调线粒体外膜蛋白VDAC1在蛋白和mRNA表达水平（P<0.05）。在36μg/mL浓度组提前2 h进行CsA预处理,与单独36μg/mL MC-LR组相比,可显著抑制Cytc从线粒体释放到细胞质（P<0.05）,但对VDAC1蛋白相对表达无明显抑制作用。结论1.p53依赖途径介导MC-LR致大鼠睾丸支持-生精共培养细胞凋亡过程2.MC-LR诱导大鼠睾丸支持-生精共培养细胞mPTP开放,促进Cyt c释放3.细胞周期阻滞可能参与了大鼠睾丸支持-生精共培养细胞凋亡的发生