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多环芳烃(PAHs)是一类由两个或两个以上苯环组成的持久性有机化合物,在环境中广泛分布,以其致癌、致畸、致突变性严重威胁着生态环境和人类健康。微生物降解是环境中PAHs去除的主要途径,而对PAHs微生物降解机制的阐明成为PAHs生物修复领域中的研究热点。
本研究将采集自漳州浮宫红树林湿地沉积物样品,在持续性的高浓度、混合PAHs选择压力下进行富集驯化,获得新型、具有高效PAHs降解能力的微生物,同时对筛选获得的PAHs降解菌从生理生化角度、基因组学、蛋白质组学和转录组学等方面进行了探索性的研究,探讨其降解特性,捕捉相关功能基因及功能酶,并在这些基础上推测其代谢途径。通过研究,获得的主要结果如下:
1.利用高浓度(1000 mg L-1)、混合PAHs(菲、芘、荧蒽和苯并[a]芘)为碳源,结合改良的平板升华法,从漳州浮宫红树林湿地沉积物样品筛选到3株具有PAHs降解能力的可培养单菌,编号为F2,F19和B17。16S rRNA基因鉴定结果显示这三株细菌分别为新鞘氨醇菌属(Novphingobium)、海细菌属(Marinobacterium)和海杆菌属(Marinobacter)。菌株F2与Novosphingobiumpentaromativorans US6-1T的相似度为99.9%,菌株F19与Marinobacterium litoraleIMCC1877T相似度最高,达到96.8%,菌株B17与Marinobacter mobilis CN46T的相似度最高,达到97.9%。通过生理生化特性、脂肪酸成分的分析,G+C mol%的测定和DNA-DNA杂交结果表明菌株F19和B17分别为海细菌属和海杆菌属的一个新种。
2.分别测定了菌株F2、F19、B17和US6-1对菲、芘的降解能力,并采用均匀设计方法优化了菌株US6-1对芘、荧蒽和苯并[a]芘等高分子量PAHs的降解条件。优化后,US6-1对芘、荧蒽和苯并[a]芘的降解能力分别达到了6.46 mg L-1d-1、6.86 mg L-1 d-1和4.74 mg L-1 d-1。这是首次将均匀设计方法运用于海洋细菌PAHs降解条件优化的研究报道。
3.运用双向电泳技术(2-DE)比较分析了Novosphingobium sp.F2在菲、芘诱导下蛋白表达图谱,从中获得在芘诱导24h后表达量上升的12个蛋白,以及在菲诱导24 h后增量表达的11个蛋白,经MALDI-TOF-TOF-MS鉴定获得包括单加氧酶、双加氧酶,脱氢酶、脱羧酶等参与PAHs代谢的关键酶,以及调控其它生理代谢过程的蛋白。
4.以蛋白鉴定结果为依据,成功克隆得到PAHs降解代谢过程中起关键作用的酶环羟基化双加氧酶(RHD)和邻苯二酚2,3-双加氧酶(C23O)的编码基因。经序列分析,该C23O基因为尚未报道过的新基因,并实现了C23O基因在宿主E.coli BL21(DE3)中的表达。
5.利用实时荧光定量PCR技术(real-time PCR)从转录水平上分析了RHD基因和C23O基因在菲、芘和苯并[a]芘诱导下的表达,结果表明菲和苯并[a]芘可以促进两基因的表达,而芘则抑制其表达。