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解旋酶是一类马达蛋白,广泛存在于原核生物、真核生物及病毒中,在核酸的代谢过程中发挥着重要作用,其缺失或者突变会导致多种遗传疾病的发生。Pif1解旋酶是解旋酶家族中一个重要的分支,已有实验证明,Pif1解旋酶在DNA的复制与修复,基因的转录,线粒体DNA稳定的维持,端粒酶活性的抑制及冈崎片段成熟的促进等过程中发挥着重要作用。尽管在之前的研究中人们已经找到了一些有关Pif1解旋酶的共性和特性,但是就目前来看,还存在着很多不足之处。首先,在对Pif1解旋酶氨基酸序列的保守性分析中发现,Pif1解旋酶保守的氨基酸序列主要集中在解旋酶的核心区,NTD（N-terminal domain）和CTD（C-terminal domain）中含有大量的不保守序列,这些不保守的序列所发挥的作用人们还不是很清楚;第二,由于技术条件的限制,人们之前对解旋酶的大部分研究仅限于细胞层面,而没有深入到分子层面和原子层面,导致人们对很多问题的认识不够深入和全面。鉴于此,本课题以白假丝酵母（Candida albicans）的Pif1解旋酶为实验材料,结合快速停留荧光共振能量转移（stopped-flow FRET）、单分子荧光共振能量转移（single molecule fluorescence resonance energy transfer,sm FRET）、荧光偏振（fluorescence polarization）、凝胶过滤层析（gel filtration chromatography）、动态激光散射（dynamic laser scattering,DLS）、小角X射线散射等技术（small angle X-ray scattering,SAXS）以及生物大分子晶体学对其结构与功能做了全面而又细致的研究。获得的主要结论如下:（1）CaPif1蛋白的解旋方向为5′-3′,蛋白无使双链DNA退火的活性,解双链的全局动力学步长为1 bp,解旋速率约为110 bp/s,持续解旋距离约为11 bp;CaPif1蛋白在面对多种底物时,更倾向于解开带有5′单链DNA的底物,其解旋复制叉状底物时的速率要高于Bs Pif1和h Pif1解旋酶,预示着其可能在DNA的复制过程中发挥着重要作用;CaPif1蛋白还可以高效的解开G4结构以及DNA与RNA的杂交链,解旋的速率均高于解双链的速率,预示着其在抑制端粒酶活性及调节转录的过程中发挥着重要作用。（2）smFRET实验发现低浓度的CaPif1蛋白解双链底物时,有两种解旋状态,一种是直接解旋,另外一种是有停留的解旋,其中有停留的解旋约占总反应的10%,这种有停留的解旋可能与蛋白的变构有关;低浓度的CaPif1蛋白解旋带有G4结构的底物时,并不是一次性的将G4结构打开,而是分步进行的。其在解旋G4结构时,首先将G4结构解开为G3或者G2结构,但由于G4结构比较稳定,G3或者G2结构很有可能又退火成G4结构,从而出现反复解旋的现象。（3）CaPif1蛋白单独的NTD对单链DNA无亲合活力,但却可以促进蛋白对底物的识别与结合,提高蛋白解旋核酸底物的能力;CaPif191-906蛋白为二聚体,控制CaPif191-906蛋白二聚的肽段位于第91至138位氨基酸之间。与Sc Pif1蛋白不同的是,CaPif1蛋白的二聚不依赖于DNA链的诱导,其二聚的位点可能与蛋白之间的识别有关;CaPif1蛋白的CTD对于蛋白的结合活力及稳定性有影响,若将CTD完全去掉,蛋白的稳定性会下降,对单链DNA的结合能力也会下降。（4）结构生物学研究表明,CaPif1蛋白中有Q-motif（Q373）存在,能特异的识别并结合ATP;CaPif1蛋白的第473位的谷氨酸和第512位的谷氨酰胺与ATP的水解有关,它们突变后会导致CaPif1蛋白的解旋活力丧失;CaPif1蛋白的多个氨基酸参与了同核酸链的结合,其第434位和第818位的组氨酸可以阻碍CaPif1蛋白与RNA单链的结合,使得CaPif1蛋白在解旋DNA与RNA的杂交链的过程中,能特异的识别并结合DNA链,而将RNA链移除;CaPif1蛋白在结合了单链DNA以后,2B结构域的扭转角度与其它已知结构的Pif1蛋白都不同,CaPif1蛋白2B结构域所能扭转的角度小于Bs Pif1蛋白和Sc Pif1蛋白,这种特性,使得CaPif1蛋白很难识别并结合具有较大空间结构的核酸底物;CaPif1蛋白的1A结构域和2B结构域之间存在一对二硫键,这对二硫键会将1A结构域和2B结构域锁定,从而限制了2B结构域的活动,最终影响蛋白的解旋活力;CaPif1蛋白的2C结构域在蛋白的折叠以及维持蛋白稳定性发面发挥着重要作用。G4 DNA广泛存在于生物的基因组内,与DNA的复制,基因的转录及端粒的调控有关。已有很多证据表明Pif1解旋酶与G4结构有联系,但到目前为止,人们还没有获得Pif1蛋白与G4 DNA复合物的晶体结构。本课题对CaPif1蛋白与G4 DNA的复合物的结构做了初步的研究。获得的主要结论如下:PyMOL软件模拟的CaPif1蛋白与带有5′单链尾巴的G4 DNA的复合物的结构模型显示,单链DNA位于CaPif1蛋白的两个Rec A样结构域组成的带正点荷的凹槽内,G4结构位于1A结构域和2B结构域的外侧,G4结构主要与表面正电荷比较密集的1A结构域相互作用;CaPif1蛋白可与两端均带有单链尾巴的G4 DNA形成二聚体复合物,小角X射线散射实验发现,两个CaPif1蛋白以中心对称的方式分布于G4结构的两侧,该二聚体复合物的整体结构比较致密,通过结晶初筛实验,可以得到该复合物的晶体,目前的分辨率可以达到5埃。以上,是本研究发现的CaPif1蛋白主要的酶学特性和结构学特性,从中可以找到一些该蛋白与其它解旋酶类似的性质,也可以找到一些该蛋白所特有的性质。这些结果,可以为人们更加全面的了解Pif1蛋白的结构与功能提供一些参考和依据。