前言骨肉瘤是临床常见的成骨性恶性肿瘤,约占所有骨肿瘤的20%。其恶性程度高,易复发和转移,预后较差。随着分子生物学理论和技术水平的提高,尤其是肿瘤分子生物学的发展,骨肉瘤的发生机制在分子水平上有了新的认识。近年来的研究表明,S100A4基因和蛋白的异常表达与恶性肿瘤的生物学行为密切相关,特别在肿瘤的侵袭和转移中发挥着重要的作用。有关S100A4蛋白与多种肿瘤生物学特性的研究已相继开展。S100A4蛋白是1989年由Sbralidze从高转移性小鼠乳癌细胞中克隆出来的一种转移相关基因。1992年克隆了人类S100A4基因。该基因位于染色体1q21,基因全长2837bp,编码101个氨基酸的蛋白。该区易发生各种染色体的缺失、易位、重叠等改变,提示S100A4蛋白与肿瘤的发生发展关系密切。S100A4蛋白与Ca离子结合后可能导致S100A4蛋白构型改变,在表面暴露新的结合位点,从而可与一系列靶蛋白结合。S100A4蛋白通过参与降低肿瘤细胞间粘附力、增加肿瘤细胞的运动能力、重塑细胞外基质、抑制细胞凋亡,促进细胞异常增生、促进新生血管生成等各个阶段,进而促进了恶性肿瘤的侵袭和转移。对S100A4蛋白结构功能以及编码基因的研究有待于进一步深入。S100A4蛋白不仅有希望成为恶性肿瘤的诊断指标和评估患者预后的肿瘤标记物；而且有希望通过下调S100A4基因表达使其成为针对恶性肿瘤基因治疗的新靶点。RNA干扰(RNA interference, RNAi)是近年来发现的研究生物体基因表达、调控与功能的一项新技术,它利用了由小干扰RNA (small interfering RNA, siRNA)引起的生物细胞内同源基因的特异性沉默现象,其本质是siRNA与对应的mRNA特异结合、降解,从而阻止mRNA的翻译。RNAi是生物进化的结果,是生物体对病毒基因等外源核酸侵入的一种保护性反应。它普遍存在于各种生物,具有抗病毒、稳定转座子及监控异常表达mRNA的生物学功能。RNA干扰现象不仅能提供一种经济、快捷、高效的抑制基因表达的技术手段,而且有可能在基因功能测定,基因治疗等方面开辟一条新思路。本研究首先验证S100A4基因在不同的人骨肉瘤细胞系和骨肉瘤组织中的表达情况,再应用RNA干扰技术,抑制人骨肉瘤MG-63细胞S100A4基因的表达,并观察其对细胞增殖及体外侵袭能力的影响,初步探讨其作用机制。本文共分三个部分,第一部分：S100A4在骨肉瘤细胞系中基因水平的表达研究；第二部分：S100A4和CD44V6在骨肉瘤组织中的表达及相关性研究；第三部分：RNAi抑制S100A4基因表达及其对人骨肉瘤MG-63细胞生物学特性和侵袭、转移能力的影响并初步探讨其作用机制。目的第一部分：检测在人骨肉瘤细胞系MG-63及U-20S中S100A4基因的表达情况；第二部分：检测骨肉瘤组织中S100A4和CD44V6的表达情况,并分析其临床意义；第三部分：RNAi技术抑制人骨肉瘤MG-63细胞S100A4基因的表达,并观察其对细胞增殖及体外侵袭能力的影响,并初步探讨其作用机制。方法第一部分：人骨肉瘤细胞MG-63及U-20S购自中科院上海细胞研究所,应用Real-time PCR方法检测S100A4基因在人骨肉瘤细胞MG-63及U-20S中的表达；第二部分：收集中国医科大学附属第一医院2004-2008年收治的骨肉瘤病例33例,2008年收治的骨软骨瘤病例13例。用SP法检测骨肉瘤S100A4、CD44V6蛋白表达,探讨骨肉瘤组织中S100A4和CD44V6表达的关系及与临床病理因素的联系；第三部分：依据Ambion公司提供的设计原则,根据S100A4基因在GenBank中序列设计相应的siRNA,合成针对S100A4的siRNA载体。荧光倒置显微镜下观察转染情况,应用Real-time PCR方法检测转染前后S100A4基因表达的变化,应用Western-Blot方法检测转染前后S100A4蛋白表达的变化。筛选出转染效率比较高的特异性siRNA作为后续试验的转染实验组,应用MTT法和平板克隆形成实验检测细胞增殖率的变化,应用Transwell小室实验检测细胞侵袭、转移能力的变化,并应用Real-time PCR方法检测转染前后CD44和MMP2基因表达的变化,初步探讨RNA干扰抑制人骨肉瘤细胞S100A4基因的表达对细胞侵袭、转移能力影响的可能机制。结果第一部分：Real-time PCR反应结果显示,人骨肉瘤细胞系MG-63及U-20S中均有S100A4基因表达,并且它们的表达程度接近；第二部分：S100A4蛋白在骨肉瘤组织中表达的阳性率是69.7%,阳性表达的位置在骨肉瘤细胞的细胞浆,对照组未见S100A4蛋白表达。CD44V6蛋白阳性表达的位置在骨肉瘤和骨软骨瘤细胞的细胞膜和近膜的胞浆,在骨肉瘤组织中表达的阳性率是60.6%,在骨软骨瘤中的阳性率仅为7.7%。本实验检测的骨肉瘤组织中S100A4和CD44V6的表达具有相关性(r=0.413,P<0.05),S100A4和CD44V6在骨肉瘤组织中的表达水平与患者的性别、年龄、肿瘤原发部位、肿瘤细胞病理分型进行比较,差异无统计学意义(P>0.05)；第三部分：倒置显微镜下转染非特异性siRNA组(C2组)、转染特异性siRNA组(S1、S2、S3组)可见绿色荧光,表达部位在细胞浆。各特异性siRNA转染组S100A4 mRNA表达水平有不同程度的下调,以siRNA3组最为显著,Western-Blot检测S100A4蛋白表达得到相似结论。MTT法和平板克隆形成实验均显示特异性siRNA转染组能够抑制细胞的增殖,与对照组,非特异性组比较有显著性差异(P<0.05)。Transwell小室实验显示：RNA干扰S100A4基因表达后肿瘤细胞的运动侵袭能力明显下降,穿过人工基底膜的细胞数量明显减少,与空白对照组、阴性对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。用双标准曲线的方法比较S100A4特异性siRNA转染前后CD44和MMP2表达的变化,抑制S100A4基因的表达同样影响到CD44和MMP2的表达,CD44的表达下降到42.33%±0.0322,MMP2的表达下降到71.67%±0.0551,差异有统计学意义(P<0.05)。结论第一部分：在人骨肉瘤细胞系MG-63及U-20S中,均有S100A4基因的表达,并且它们的表达程度接近；第二部分：S100A4在本实验检测的骨肉瘤组织中有较高水平的表达,并且与CD44V6在骨肉瘤组织中的表达有相关性；第三部分：体外合成的S100A4特异性siRNA载体能够有效抑制骨肉瘤细胞系MG-63中S100A4的表达,抑制细胞的增殖,抑制细胞的体外侵袭能力,S100A4基因的表达减弱可以抑制CD44和MMP2基因的表达而降低骨肉瘤细胞的侵袭、转移能力。RNA干扰技术为骨肉瘤的治疗提供了一种新的思路,S100A4基因与骨肉瘤的侵袭、转移密切相关,应用此技术抑制S100A4基因的表达可能成为骨肉瘤手术、化疗、放疗等传统治疗的辅助手段,本研究为应用RNAi进行肿瘤的基因治疗提供了实验依据。