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股骨头坏死(ONFH)是骨科常见的难治性疾病。由于使用激素导致的激素性股骨头坏死(SONFH)在非创伤性的ONFH中占有很大比例。激素导致 ONFH具体机制目前尚无统一的认识,有脂肪代谢紊乱、血管内凝血、骨质疏松等多种学说,也有学说认为是由于激素导致骨髓间充质干细胞(BMSCs)成脂分化,造成成骨不足引发的。 ONFH早期症状不明显,无特异性体征,极易误诊误治,晚期致残率高,故应早诊断早治疗。目前的早期诊断主要依靠影像学检查,但 X线和计算机断层 X线扫描(CT)对早期的ONFH敏感性均较差,磁共振成像(MRI)是诊断 ONFH最敏感的手段,而由于其费用较高影响了它的普及,目前尚未有公认的优于 MRI的早期诊断方法。一种疾病的发生或发展,其体内分子水平的变化必然先与影像学变化,生物标志物(biomarker)是体内发生的与发病机制相关的关键事件的指示物,是机体由于接触各种环境因子所引起机体器官、细胞、亚细胞的生化、生理、免疫和遗传等任何可测定的改变,是近年医学研究的热点,可指导医生在临床上对某一疾病作出快速诊断或预警。对于SONFH,寻找一个有效的生物标志物以协助诊断或预警显得非常重要。 中医药在 SONFH的早期防治中起着重要作用。有多种中药成分或复方证实对早期的SONFH有效。木豆叶是豆科植物木豆的干燥叶片,有活血化瘀、消肿止痛、补肾壮骨、去腐生肌之功效,临床已证实其对股骨头坏死有显著地疗效,但其具体作用机制仍有待研究。 蛋白质组学(proteomics)是在整体上研究蛋白质组成、表达和规律的学科,在相关疾病生物标志物的筛选,药物的作用机理研究等方面发挥着重要的作用,通过蛋白质组学方法对 SONFH筛选生物标志物,对探讨 SONFH发病机理,协助接受激素治疗患者诊断或预警有重要的意义。同时,对木豆叶开展蛋白质组学研究,也利于了解中药具体的作用机制。 目的: 1.比较 SONFH患者和正常人血清中的蛋白质表达差异,探讨 SONFH的机制并筛选可以预警或早期诊断SONFH的生物标志物。 2.研究大剂量激素干预后 BMSCs的蛋白质变化,以及木豆叶含药血清培养激素干预后 BMSCs蛋白质的变化,试从 BMSCs角度探讨激素导致 SONFH的原因和木豆叶治疗SONFH的作用机理。 方法: 1.收集2011年3月至2012年9月在广州中医药大学第一附属医骨科门诊或住院部关节一科就诊治疗的确诊为 SONFH患者的血清样本12个,正常人血清样本10个,将样本分别混合后使用双向电泳的方法建立其血清蛋白图谱,找出两者表达出现显著差异的蛋白质,使用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-TOF-MS)鉴定并查询其功能,筛选出其中的有意义的蛋白。 2.将大鼠平均分为木豆叶组和对照组,分别使用木豆叶和生理盐水灌胃,1周后收集血清。采集人骨髓培养BMSCs,培养至第三代时将BMSCs分为对照组、激素组和木豆叶含药血清组,对照组常规培养基培养,激素组和木豆叶含药血清组使用含甲强龙的培养基干预,3天后对照组单纯用含对照组大鼠血清的培养基培养,激素组使用含甲强龙和对照组大鼠血清的培养基培养,木豆叶组使用含甲强龙和木豆叶组大鼠血清的培养基培养,5天后收集三组细胞并提取蛋白,通过双向电泳的方法分析正常组和激素组,激素组和木豆叶含药血清组的差异,找出两者表达出现显著差异的蛋白,MALDI-TOF-TOF-MS鉴定并查询蛋白质功能,筛选其中的有意义的蛋白。 结果: 1.激素性股骨头坏死患者血清同正常患者相比,20个蛋白质点出现显著差异,其中表达升高14个,表达降低6个。 2.激素组 BMSCs相比对照组有38个蛋白点发生显著变化,其中上调29个,下调9个。木豆叶含药血清组BMSCs相比激素组28个蛋白点发生显著变化,其中上调20个,下调8个。 结论: 1.激素性股骨头坏死血清内的锌α2糖蛋白和载脂蛋白 AI(表达降低,载脂蛋白 E前体,血浆谷胱甘肽过氧化酶和四连接素表达升高,表明患者体内脂肪代谢紊乱,同时存在组织的修复,这几种蛋白可作为潜在的血清标志物进一步研究验证。 2.激素组 MSCs相比于对照组脂肪酸合成酶表达上升、非肌肉肌球蛋白重链表达下降,表明大剂量激素影响了 MSCs正常的脂类代谢、细胞粘附和分化等功能,可能是激素造成股骨头坏死的原因之一。而木豆叶含药血清组相比于激素组,热休克蛋白和含缬酪肽蛋白表达上升,说明木豆叶可能通过增强这两种蛋白的表达阻止细胞凋亡,COP9的上升可能与JNK途径有关,但木豆叶是否通过此途径影响MSCs的分化还需进一步证实。