【摘 要】
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轮状病毒（Rotavirus,RV）可以感染猪、牛、犬猫等多种幼龄哺乳动物,引起腹泻,也可导致5岁以下儿童和婴幼儿感染急性胃肠炎,是一种重要的人畜共患病原体。但目前对不同宿主源轮状病毒相关研究较少,本研究以此为出发点,收集湖北部分地区人、猪、伴侣动物犬猫腹泻相关样品,开展RV的检测及其病原的分离鉴定,同时进行全基因组序列的测定,分析其11个基因片段的基因型,构建各基因片段的进化树,研究其各基因片段
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轮状病毒（Rotavirus,RV）可以感染猪、牛、犬猫等多种幼龄哺乳动物,引起腹泻,也可导致5岁以下儿童和婴幼儿感染急性胃肠炎,是一种重要的人畜共患病原体。但目前对不同宿主源轮状病毒相关研究较少,本研究以此为出发点,收集湖北部分地区人、猪、伴侣动物犬猫腹泻相关样品,开展RV的检测及其病原的分离鉴定,同时进行全基因组序列的测定,分析其11个基因片段的基因型,构建各基因片段的进化树,研究其各基因片段的遗传进化关系,以及猪、犬轮状病毒与人轮状病毒的交叉重配关系。主要研究结果如下:1.湖北地区RV流行情况本研究在2018年12月～2020年12月期间,对湖北武汉市、襄阳市和宜昌市的各医院、猪场和宠物医院的人、猪和犬腹泻相关样品和猪肠组织进行采集,共计513份,经RT-PCR检测结果表明,人RV阳性率21.63%（69/319）,猪RV阳性率为35.29%（6/17）,犬RV阳性率为1.12%（2/177）。进一步对阳性样品进行病毒分离鉴定及全基因组测定,了解RV在猪群、宠物犬及人中的感染情况以及其基因型和遗传特征的变化。以期进一步为不同宿主源RV的跨种间传播提供科学证据。2.RV的分离与鉴定为分离和获得RV流行毒株,本研究首先确定易感细胞的最佳胰蛋白酶耐受浓度,最后确定MA-104细胞对所有阳性样本进行RV的分离,使用终浓度为10μg/m L的胰蛋白酶溶液处理病毒液,之后维持液中添加终浓度为5μg/m L的胰蛋白酶。病料接种细胞后进行盲传分离,第6代培养物在接种细胞后48 h出现细胞聚集、皱缩、脱落和拉网状等明显的细胞病变。连续传至第10代后细胞病变呈现稳定的状态,经RT-PCR和间接免疫荧光鉴定为RV。进一步通过PCR扩增VP6基因测序表明,本研究成功分离到湖北地区11株HRV毒株和2株Po RV毒株。经空斑纯化稳定传代的2株Po RV毒株RVA/Porcine/CHN/HB-1/2019和RVA/Porcine/CHN/HB-7/2019的TCID50分别为105.63TCID50/m L、106.1TCID50/m L。结合分离株的全基因组测序结果,本研究首次在国内分离得到G9P[8]型Po RV毒株,为进一步研究G9P[8]型Po RV毒株的生物学特性奠定了基础,也为进一步分析其可能的遗传重配提供了实验材料和研究基础。3.RV的全基因组测序与重配分析为进一步研究成功分离到的11株G9P[8]型HRV毒株和2株G9P[8]型Po RV毒株的各基因片段的基因型及遗传进化关系,本研究共设计15对引物,采用RT-PCR的方法,获得分离株全基因组序列。基因组遗传进化分析显示,有8株G9P[8]HRV毒株在Wa-like的RV基因型中具有DS-1-like的NSP4 E2基因型,提示存在自然发生的基因组间重配现象。2株G9P[8]型Po RV毒株基因组遗传进化分析显示该猪源RV毒株的7个基因片段（VP4、VP1、VP2和NSP2-NSP5）与武汉的人源L2448株及本研究分离的11株G9P[8]型HRV毒株亲缘关系最近,VP7和VP6基因则与武汉的猪源TM-a毒株亲缘关系最近,提示猪和人轮状病毒毒株在中国湖北地区出现重配及跨种间传播的现象。
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