【背景】锰是大量存在于地壳的自然元素,也是人体必需的一种微量元素。然而过量锰暴露是一种公认的环境健康危险因素,可诱导多种神经系统症状,尤其是类似于帕金森病(Parkinson’s disease,PD)的锥体外系功能异常。环境锰污染及其带来的健康问题是一个重要的公共卫生问题。自噬-溶酶体途径(autophagy-lysosome pathway,ALP)是真核细胞降解蛋白质及功能失调的细胞器的重要途径,与泛素-蛋白酶体途径(ubiquitin-proteasome pathway,UPP)一起在维持细胞内环境稳态过程中发挥着重要的作用。近年来的研究结果表明,ALP功能的异常在多种神经系统退行性疾病的发生过程中发挥着关键的作用。ALP功能的下降将导致多种神经毒性蛋白在神经元的异常蓄积,并进一步导致神经退行性病变的加重。反之,过高的自噬水平也可导致神经元的变性坏死,尤其是在一些神经毒性物质诱导的毒性过程中发挥着关键的作用。【目的】通过建立锰中毒的细胞模型,探讨锰对神经元自噬水平的影响,并进一步研究自噬水平的改变在锰诱导的神经毒性过程中的作用。研究结果可望为进一步阐明锰神经毒性的分子机制以及提出新的锰神经毒性防护措施提供思路。【方法】1.利用PC12细胞建立锰诱导DA神经元损伤的体外模型。2.利用流式细胞术、MTT、LDH活性检测等方法测定细胞活力及细胞毒性。3.电镜、免疫荧光染色、Western Blot等方式检测自噬水平的改变。4.Western Blot技术检测自噬相关底物α-synuclein表达水平的改变。【结果】1.锰中毒体外模型的建立MTT实验结果显示锰作用相同时间,随着作用浓度的增高,细胞活力逐渐下降。LDH活性检测结果显示,PC12细胞的损伤程度逐渐随着锰作用浓度的增高而加重。流式细胞仪分析结果显示,锰作用后,细胞死亡率随锰作用浓度的增高而增高。2.锰可诱导PC12细胞自噬水平的改变在诱导细胞损伤的同时,锰诱导自噬水平的改变。电镜结果显示, 300μmol/L锰作用24h后出现典型的自噬超微结构的改变。MDC染色以及EGFP-LC3转染均可观察到典型的自噬形态学改变。而Western Blot结果显示微管相关蛋白LC3-II/LC3-I的值以及自噬相关基因Beclin 1的表达在300μmol/L的锰作用12h、24h均呈增高趋势。进一步的研究发现,锰诱导的自噬水平的改变主要是由于自噬体生成的增多而溶酶体降解功能的异常。自噬抑制剂3-MA可使染锰PC12细胞内的自噬囊泡(Avs)显著减少;而溶酶体抑制剂Leu则由于抑制了溶酶体的降解功能而使自噬体数量增多。3.自噬在锰诱导的PC12细胞损伤中作用的初步探讨MTT、LDH以及流式细胞仪检测结果显示,自噬增强剂可缓和锰诱导的PC12细胞增殖活力下降、LDH的释放以及死亡率的增高,而自噬抑制剂则加剧锰诱导的细胞损伤;反之,自噬增强剂可抑制锰诱导的细胞损伤。同时,锰可诱导α-synuclein表达水平的增高,而增强自噬可抑制其表达;反之,抑制自噬则促进α-synuclein的过表达。【结论】1.在诱导PC12细胞增殖抑制、损伤以及死亡率增高的同时,锰可以诱导自噬水平增高。2.在锰诱导的自噬水平改变的过程中,自噬体生成的增多而非溶酶体降解功能的下降发挥了主要的作用。3.锰诱导的自噬水平增高可能是一种代偿性的保护效应,抑制自噬可增强其毒性损伤效应,而增强自噬则可抑制锰诱导的神经元损伤。4.促进自噬后,染锰组α-synuclein表达水平有所降低,而抑制自噬水平后α-synuclein表达增高的现象更加明显。结合以往的研究结果,我们推测,增强和抑制自噬对锰诱导的PC12细胞毒性的影响可能与异常蓄积α-synuclein降解有一定的相关性。综上所述,本研究初步阐明了锰对多巴胺能神经元自噬水平的影响及其在锰诱导的神经毒性中的作用,结果将为进一步阐明锰神经毒性的分子机制以及探寻有效的防护措施提供新的思路和理论依据。