苹果果实cDNA文库的构建

来源 :中国农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:nice_hope
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本实验以新红星苹果为研究材料,采用CTAB法成功的从苹果果实里提取了高质量的RNA。利用MMLV反转录酶把总RNA中的mRNA反转录成cDNA,用特异引物进行LD—PCR扩增合成双链cDNA。然后用CHROMA SPIN—400Column对cDNA进行分级分离,去除小于500bp的cDNA片段。用带有粘性末端双链cDNA与λ Trip Ⅰ Ex2载体连接,利用λ噬菌体包装蛋白对合成的双链cDNA进行体外包装。包装产物侵染E.coli XL-Blue后构建cDNA文库,最后进行文库的扩增。该cDNA文库的滴度为1.191×10~6,文库的克隆数为1.112×10~6,扩增后滴度为1.532×10~10,插入片段平均大小在1 kb左右,蓝白斑筛选证实其重组率大于95%。同时,由于反转录过程中采用附加序列的方法使全长mRNA得到反转录,所以得到的cDNA是完整的,完全符合cDNA文库的要求。本实验成功构建了新红星苹果果实cDNA文库。
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