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淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)1628是项目组前期从浙江省天目山土壤中分离到的一株具有生防功能的放线菌。对该菌株代谢产物活性成分分离鉴定表明,活性化合物主要为丰加霉素、四霉素A、四烯菌素B和新化合物四霉素P。前期实验室利用核糖体工程技术获得了4株来源不同并具有不同表型的高产突变菌株10(str~r)、88(rif~r)、99(par~r)和143(str~r),在此研究基础上,本论文利用基因组重排技术对这些高产菌株进行遗传改造,通过优化菌株原生质体融合条件,融合菌株中rsmG、rpsL和rpoB等基因的突变位点检测,高产融合菌株的生长特性等研究,以期提高淀粉酶产色链霉菌发酵水平,具体研究结果总结如下:1.利用正交试验法优化了原生质体最佳融合条件:原生质体在40%PEG4000溶液中,并置于20℃下融合10 min,能获得最大融合效率,融合效率为7.29%。2.前期利用核糖体工程获得不同表型的高产突变菌株10(str~r)、88(rif~r)、99(par~r)和143(str~r),对这些菌株进行3轮基因组重排,并经过链霉素、利福平和巴隆霉素筛选,最终获得了丰加霉素高产菌株R3-33和四烯大环内酯类抗生素高产菌株R3-37。在GYM培养基中,R3-33丰加霉素的产量达到了644.5mg/L,是亲本菌株10(str~r)的5.9倍。R3-37四霉素P、四烯菌素B和四霉素A的产量分别为442.2 mg/L、155.5mg/L和377.6 mg/L,是亲本菌株10(str~r)的5.4倍、2.8倍和4.2倍。3.高产菌株突变位点的检测分析。基因组重排中的亲本菌株是由不同抗生素筛选得到的,其具有rpsL、rsmG和rpoB三种不同的突变类型。对高产菌株进行rpsL、rsmG和rpoB突变位点检测分析,发现经过三轮基因组重排获得的丰加霉素高产菌株R3-33的rsmG基因发生了无义突变,第48位编码半胱氨酸的密码子变成了终止密码子,rpsL基因第365位基因G突变为T,使得第122位编码甘氨酸的密码子突变为缬氨酸密码子;四烯大环内酯类抗生素高产菌株R3-37检测到其rsmG基因发生了无义突变,第48位编码半胱氨酸的密码子变成了终止密码子。亲本菌株的3种突变类型中,重组至融合菌株的只有菌株10(str~r)的rsmG突变,而rpoB和rpsL突变并未融合至高产菌株中。R3-33发生的rpsL突变可能是亲本菌株筛选过程中产生了自发突变。4.高产菌株的生长特性研究。相较于野生型菌株1628,融合菌株R3-33和R3-77的生长速率变缓,其代谢产物合成时间延长;菌丝生长量也有明显变化,每毫升培养基中高产突变株的菌丝干重分别达6.1 mg和6.5 mg,而野生型菌株仅为2.6 mg;R3-33和R3-37菌株次生代谢产物的合成量和培养条件密切相关。利用HPLC检测分析发现,在TPM培养基中R3-33丰加霉素产量可高达1173.6mg/L,出发菌株10(str~r)的10.6倍,R3-37的四霉素P、四烯菌素B和四霉素A的产量达到了965.2 mg/L、475 mg/L和832 mg/L,是出发菌株10(str~r)的11.7倍、8.4倍和9.2倍。本研究结果为S.diastatochromogenes的育种供了新的思路和方法。使用基因组重排技术对S.diastatochromogenes进行递归原生质体融合和筛选,能有效提升其次级代谢水平,且相较于传统育种方法更为省时省力、经济快速。