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日益增多的研究表明microRNhs在真核生物发育进程和应激反应的基因表达调控中起着重要的作用。一些植物miRNAs的表达水平受非生物胁迫上调或下调,它们可能在植物非生物胁迫反应的基因转录后调控中起着作用。本文主要通过以拟南芥miRNA393家族为研究对象,初步探索了植物miRNA393的生物合成和表达模式,及干旱和盐胁迫中miRNA表达差异对拟南芥耐逆性的影响,主要结果如下：
1.构建了miRNA393的三类不同前体茎环结构的植物表达载体：(1)克隆拟南芥内源miR393基因家族的两个成员MIR393a和MIR393b,构建超达载体35S::miR393a和35S::miR393b；(2)以拟南芥miR319a的茎环结构,人工构建miR393超表达载体35S::amiR393；(3)以哺乳动物大鼠miR155的茎环结构,构建miR393超表达载体35S::mmiR393。
2.通过农杆菌介导法转化拟南芥,潮霉素筛选获得转基因株系5个,并经过GUS染色、PCR和RT-PCR检测。转miRNA393基因拟南芥没有观察到明显的表型差异。
3.为了检测转基因株系中miRNA前体和成熟miRNA的表达水平,进行了RealTime RT-PCR和Northern blot分析,结果显示35S::miR393b三个株系的pre-miR39 3b和成熟miR393表达量均明显增加；采用动物前体结构的35S::mmiR393的转基因株系中前体pre-mmiR393大量表达,但是成熟miR393的积累水平没有明显变化,说明动物来源的miRNA前体茎环在植物中不被加工或者加工效率很低。
4.对拟南芥miRNA合成过程中的三个关键酶突变体hy11-1,dc11-1,ago1,以及miR393过量表达的转基因株系进行了PEG模拟干旱和高盐胁迫实验。结果显示:dc11-1和ago1突变体对干旱和高盐环境的敏感性比野生型高；hy11-1突变体比野生型具有更强的耐脱水能力,而对高盐条件敏感。过量表达miRNA393转基因株系对干旱和高盐的耐受能力没有提高。
5.通过克隆拟南芥MIR393a和MIR393b茎环序列上游区域1.5kb-2kb的片段,构建了GUS基因的启动子分析载体:pmiR393a::GUS和pmiR393b::GUS,进行拟南芥转基因实验。对转基因小苗的叶片进行GUS染色,结果显示：在正常培养条件下,转pmiR393a：:GUS基因小苗没有观察到GUS基因表达；转pmiR393b：:GUS基因小苗叶脉中表达GUS基因。推测MIR393a和MIR393b基因启动子中存在着不同的调控元件。各种胁迫条件下GUS基因表达的实验正在进行中,将为非生物胁迫反应中miRNA393基因自身表达调控机制的研究提供更多的数据。