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石油中的烷烃和多环芳烃等烃类物质是高毒性的环境污染物,具有潜伏期长、影响面大、生态危害严重、治理困难等特征,已成为环境污染的主要来源。利用微生物降解作用来清除石油中的烃类物质被认为是一种可靠、高效、环保的生物环境修复方法。本实验室前期从海洋环境中分离到一株具油类浮起特性、降解烃类物质的红球菌P14。本论文在此研究的基础上,进一步对红球菌P14降解烃类物质的相关功能基因进行研究,获得了以下主要研究结果: 1、红球菌P14降解烷烃的功能基因--烷烃羟化酶基因alkB的研究 (1)通过TAIL-PCR技术,从红球菌P14中扩增到烷烃羟化酶基因alkB1、alkB3的侧翼序列,获得一个含有alkB1的2200bp基因片段和一个含有alkB3的1400bp基因片段。其中alkB1序列全长1224bp,编码408个氨基酸;alkB3基因序列含有1152bp,编码384个氨基酸。 (2)通过RT-PCR分析,红球菌P14的alkB1、alkB3基因在烷烃C16、C24、C28诱导下表达量均上调,说明这两个基因与烷烃降解有关系。 (3)对alkB1、alkB3分别进行克隆、表达,成功构建了两株重组菌株(E.coli BL21-pET-32a(+)-alkB1、E.coli BL21-pET-32a(+)-alkB3)。在30℃培养30h,发现E.coli BL21-pET-32a(+)-alkB1对烷烃C16、C24、C28的降解率分别为61.7％、65.7%、70%,但是E.coli BL21-pET-32a(+)-alkB3对C16、C24、C28没有降解能力。 2、红球菌P14降解多环芳烃的功能相关基因--过氧化氢-过氧化物酶基因katG的研究 (1)通过二维电泳,从红球菌P14降解芘过程中得到了11种差异蛋白,经质谱鉴定分析发现其中一种与过氧化氢-过氧化物酶KatG的序列相似度较高。设计兼并引物、进行PCR,从红球菌P14中克隆到katG部分基因序列(1700bp);再通过TAIL-PCR的方法扩增其侧翼序列,获得了一段包含katG的2700bp的片段,这个片段含有两个完整ORF阅读框,其中一个为katG,含有2187核苷酸序列,编码729个氨基酸序列;而另一个为katG上游的铁吸收调节蛋白基因(furA),含有444核苷酸序列,编码148个氨基酸序列。 (2)红球菌P14降解芘过程中,katG和furA并不是共转录关系,它们是单独转录的;与对照组相比,katG在PAHs(芘、苯并芘)的诱导下表达量明显上调。 (3)对katG进行克隆、表达,成功构建了E.coli BL21-pET-32a(+)-katG重组菌株,经活性染色表明纯化的重组蛋白KatG具有活性。但重组蛋白KatG的添加,不会促进红球菌P14对芘的降解能力。