研究背景及目的胆汁淤积(Cholestasis)是由多种肝脏疾病引起的临床综合症,常与原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、Dubin-Johnson综合症等相伴[1-3]。肝炎、药物中毒、梗阻、妊娠等均可引起胆汁淤积。就分子水平而言,胆汁淤积的发生主要与位于肝细胞表面的胆酸转运蛋白MDR1(多药耐药蛋白1,Multidrug resistance protein 1)、MDR2(多药耐药蛋白2,Multidrug resistance protein 2)、MRP2(多要耐药相关蛋白2,Multidrug resistance-associated protein 2)、MRP3(多药耐药相关蛋白3,Multidrug resistance-associated protein 3)、MRP4(多要耐药相关蛋白4,Multidrug resistance-associated protein 4)等的表达异常相关。其中,MRP3、MRP4位于肝细胞基底侧膜,主要负责将有机阴离子、胆红素、药物等由肝细胞排入血液,而MRP2、MDR1、MDR2等则位于肝细胞胆管膜面,主要将一些内源性或外源性的结合产物排入胆管[4、5]。相关文献报道,胆汁淤积发生后,位于肝细胞胆管膜面的MRP2表达下降,而位于肝细胞基底侧膜的MRP3、MRP4的表达则增高,以代偿MRP2的部分功能[6]。目前,临床治疗胆汁淤积主要依靠FXR的激动剂UDCA,但是UDCA并不适用于所有人群,此外,还有利福平、苯巴比妥等,但其都具有自身局限性,而正在开发的新药GW4064和TNT747目前还处于临床试验阶段。因此,临床亟需研发新的更有效的药物。川西獐牙菜为我国藏药八宝——“藏茵陈”的主要原生植物之一,常年生长于海拔2000-5000米的青藏高原,其主要有效成分为獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、齐墩果酸、芒果苷、苦龙胆苷、当药醇苷等,具有清肝利胆,祛热退黄之功效,尤其适用于黄疸型肝炎、病毒性肝炎,是我国治疗各种肝病的传统药材[7-9]。但其清肝利胆的具体分子机制并不明确,加之成分复杂多样,因此难以被国际医学界接受。临床治疗胆汁淤积的常用药物“尤思弗”其主要成分为UDCA,即是从熊胆汁中提取出的有效成分,而我国古代便有使用熊胆汁治疗各种肝病的传统。受“尤思弗”发现、研究、推广的启发,我们对治疗各种肝病,具有“清肝利胆”作用的藏药“藏茵陈”进行研究,提取其主要原生植物——川西獐牙菜的醇提物,用以干预胆汁淤积的动物模型,以期能够发现新的治疗胆汁淤积的有效药物,弥补UCDA的不足,同时也为保护我国传统医药,维护自主知识产权做出贡献。研究方法1.建立胆道结扎的大鼠胆汁淤积模型,并对其进行药物干预,胆汁淤积模型的建立见参考文献[6]。将15只sd大鼠使用随机数字表法进行分组:(1)川西獐牙菜醇提物组、(2)udca组、(3)生理盐水组,每组5只。分别用川西獐牙菜醇提物、udca、生理盐水连续灌胃7d,7d后处死大鼠,收集血液、尿液及肝脏组织。血清学检测肝损伤指标和黄疸指标,he染色观察肝脏损伤情况,以明确川西獐牙菜对胆道结扎的大鼠胆汁淤积模型是否具有保护作用。2.药物干预正常大鼠:使用随机数字表法将10只正常雄性sd大鼠分为2组:(1)川西獐牙菜醇提物组、(2)生理盐水组,每组5只。分别用川西獐牙菜醇提物和生理盐水连续灌胃7d,7d后处死大鼠收集肝脏组织。提取大鼠肝脏rna和总蛋白,分别在mrna水平和蛋白水平检测肝细胞胆酸转运蛋白mrp3、mrp4、mrp2、mdr1、mdr2、ostα、ostβ的表达变化和核转录因子nrf2、lrh-1及核受体rxrα、rarα、vdr、pxr、car等的表达变化,最后分析其相关性,寻找川西獐牙菜醇提物对胆道结扎的大鼠胆汁淤积模型保护作用的可能分子机制。结果1.药物干预胆道结扎的大鼠胆汁淤积模型:分别用100mg/kgbodyw.t.的川西獐牙菜醇提物、udca(阳性对照)、生理盐水(阴性对照)连续灌胃大鼠7d,收集标本,血清学结果显示:与生理盐水组相比,川西獐牙菜组和udca组的肝损伤指标和黄疸指标明显低于生理盐水组,且川西獐牙菜组的各项指标较udca组降低,具有统计学意义。h.e.染色实验结果证实川西獐牙菜组大鼠肝脏损伤情况明显轻于udca组和生理盐水组。2.药物干预正常大鼠:以生理盐水为阴性对照,100mg/kgbodyw.t.的川西獐牙菜醇提物连续灌胃大鼠7d,收集大鼠肝脏组织标本后提取rna和蛋白,利用rt-qpcr和westernblot技术分别检测肝脏胆酸转运蛋白mrp2、mrp3、mrp4、mdr1、mdr2等和核受体pxr、rxrα、rarα、vdr以及核转录因子lrh-1、nrf2等的表达变化,结果显示:(1)胆酸转运蛋白:在mrna水平,与阴性对照组相较,mrp4、mrp3表达上升明显,统计学分析显示:mrp4的表达增高了2.1倍,mrp3的表达增高了1.7倍,结果显著,具备统计学意义;在蛋白水平,川西獐牙菜组mrp4、mrp3表达亦增高,其中Mrp4表达增高2.5倍,Mrp3表达增高3.0倍,结果显著,具有统计学意义。而Mdr1、Mdr2、Rxrα、Rarα、Vdr等无明显变化。同时,免疫荧光结果也显示,川西獐牙菜醇提物组其样本Mrp4、Mrp3的表达明显强于阴性对照组。(2)核受体和核转录因子:在mRNA水平,相比于阴性对照组,川西獐牙菜醇提物组Nrf2表达增高1.8倍,Lrh-1表达增高1.4倍;同时,在蛋白水平,与阴性对照组相比,川西獐牙菜醇提物组Nrf2表达增高2.3倍,Lrh-1表达增高1.3倍,Pxr表达增高1.8倍,Vdr表达增高1.8倍,结果显著,具有统计学意义。(3)胆酸转运蛋白与核受体和核转录因子的相关性分析:由于在mRNA水平和蛋白水平均发现:相较于阴性对照组,川西獐牙菜醇提物组肝细胞表面胆酸转运蛋白Mrp4、Mrp3和核受体Lrh-1、核转录因子Nrf2的表达增高,通过线性回归分析发现:川西獐牙菜可能通过Nrf2刺激Mrp4使其表达增高,而与Mrp3无关。结论(1)与生理盐水组相比,川西獐牙菜醇提物和UDCA均具有减轻肝损伤的作用,且川西獐牙菜醇提物的作用明显强于UDCA组。(2)川西獐牙菜醇提物可能通过核转录因子Nrf2调节Mrp4的表达上调,从而发挥减轻胆汁淤积大鼠肝脏损伤的作用。