论文部分内容阅读
生物体内巯基化合物对于维持细胞内环境的稳定性具有重要的意义。许多研究表明，巯基化合物不仅能够调节体内氧化还原平衡，抵御氧化应激，延缓机体衰老，增强机体免疫力，而且在排毒、解毒等方面发挥重要作用。生物体内巯基化合物分为小分子巯基化合物（如谷胱甘肽、半胱氨酸、同型半胱氨酸等）和大分子巯基蛋白（如硫氧还蛋白、金属硫蛋白等）。半胱氨酸是组成蛋白质20多种氨基酸中唯一具有还原性巯基（-SH）的氨基酸，其含量下降会引起头发褪色、组织浮肿、肝脏损伤，皮肤损害，生长过慢等等。同型半胱氨酸为体内甲硫氨酸代谢的中间产物，其浓度的变化也会增加患病的风险，例如Alzheimer’s病、心血管疾病、骨质疏松症等等。硫氧还蛋白是巯基蛋白的一种，含有典型的双巯基活性位点（-CGPC-），不仅在调节细胞氧化还原状态发挥重要作用，而且与细胞内的氧化损伤和细胞凋亡密不可分。近年来，基于荧光方法高灵敏度、高选择性以及非生物破坏性等优点，检测小分子巯基化合物的荧光传感技术迅速发展。各种各样的荧光探针被设计合成，荧光机制主要有迈克尔加成反应；磺酰胺、磺酸酯键的裂解反应；金属配合物取代配位反应；二硫键断裂反应。但是，由于小分子巯基化合物结构上相似性，区分研究各种巯基化合物（如半胱氨酸、谷胱甘肽）各自对生物体生理病理的影响，具有重要的意义。对于巯基蛋白，目前利用小分子荧光探针直接检测特定蛋白的报道还比较少。为了特异性检测半胱氨酸及双（多）巯基蛋白，我们开展了以下工作。本论文基于荧光探针与生物体内的巯基化合物作用后，荧光性质的改变，从而实现对特定物质的检测，并将探针成功用于生物体内巯基化合物的共聚焦荧光成像。本文主要包括两方面工作：（一）近红外荧光染料的激发发射波长一般位于650-900nm，具有能够深层穿透组织细胞、降低细胞自发荧光的干扰、引起低的细胞损伤等优点。因此，建立一种高灵敏的近红外荧光方法检测半胱氨酸和同型半胱氨酸至关重要。本章介绍了一种新型的近红外荧光探针Cy-O-CHO用于细胞内检测半胱氨酸和同型半胱氨酸。探针由乙基花菁和4-羟基苯甲醛反应合成，能够与半胱氨酸或同型半胱氨酸发生成环反应，并通过质谱加以验证。探针基于PET发光机制，本身荧光强度较低，与半胱氨酸或同型半胱氨酸反应后，PET过程被打断，荧光恢复。最大激发和发射波长分别位于λex/λex=730/778nm。探针的荧光强度与半胱氨酸的浓度之间存在着良好的线性关系，线性范围从0.03μM到2.0μM，线性方程为（F–F0）=1043.59+101.83×[Cys](10-7M)，相关系数为0.9941，检测限可以达到7.9nM，为目前报道的最低检测限。其他氨基酸、谷胱甘肽、金属离子及硫化氢、亚硫酸钠对检测无干扰。MTT实验证实了探针的低细胞毒性，光漂白实验也证实探针的光稳定性。探针具有良好的水溶性、高灵敏性、高选择性等优点，成功应用于细胞内源性半胱氨酸的共聚焦成像。（二）本章受Tsien等双砷染料能够检测含有四个半胱氨酸的小肽序列的启发，我们结合Se-N键的断裂反应机理，设计合成了两种以罗丹明110为母体、以依布硒啉环中的Se-N键为检测基团的荧光探针Rho-ebselen和Rho-benzene-ebselen，用于检测空间位置匹配的双（多）巯基蛋白。探针本身以内脂的形式存在，荧光较弱，当探针中的两个依布硒啉环同时与巯基蛋白中两个巯基结合后，探针形成开环结构，荧光增强。