随着基因工程的发展,微生物细胞表面展示系统已发展出噬菌体展示系统、细菌表面展示系统、酵母表面展示系统等,广泛应用在生物学研究的许多领域,例如研究蛋白质-蛋白质之间的相互识别与相互作用、由多肽构象或蛋白质突变库中获取特定功能蛋白、生产抗体、生产口服疫苗、开发全细胞催化剂、开发生物传感器和开发细胞吸附剂等等,由此成为最近几年生物技术领域的研究的热点之一毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是近年来发展迅速、应用广泛的一种真核表达系统,被认为是微生物表面展示系统极有应用前景的宿主菌之一。目前已有的毕赤酵母表面展示系统主要是利用来自酿酒酵母Flol蛋白的絮凝结构域为锚定蛋白将外源蛋白展示于菌体表面,融合蛋白非共价连接于毕赤酵母细胞壁上。为进一步的丰富毕赤酵母展示系统,并应用于南极假丝酵母脂肪酶B,本论文一方面通过构建不同锚定蛋白的毕赤酵母展示体系来筛选高活力的脂肪酶全细胞催化剂,另一方面利用定向进化技术来提高脂肪酶的热稳定性和活性,并应用于非水相中短链脂肪酸酯的合成,拟降低脂肪酶酯化合成的成本,为其大规模的工业应用奠定基础,具体的研究内容如下：1、α凝集素和絮凝素展示体系的构建本研究首先构建了α-凝集素与絮凝素C端GPI锚定的两个新型的酵母表面展示载体,结合本实验室已构建的絮凝素N端展示载体；并以南极假丝酵母脂肪酶B作为研究对象对构建的展示体系进行验证分析,采用脂肪酶的水解活力和FLAG标签蛋白标记等手段来分析目的蛋白在酵母细胞壁的锚定情况。将经平板与荧光验证的阳性重组子进行摇瓶发酵得到3种脂肪酶全细胞催化剂,分别为KNS-CALB、KFS-CALB和KFL-CALB,进一步的对其进行了酶学性质的分析。结果表明：KFS-CALB在水解活力达到270U/g dry cell和耐热性方面保温2h后的残留酶活力是最大酶活的50%以上,KNS-CALB的水解活力为200U/g dry cell,60℃保温的半衰期为1h; KFL-CALB的的水解活力为170U/g dry cell,60℃保温的半衰期为0.5h耐热性相对较差。2、新的Pir型和GPI型毕赤酵母展示CALB体系的构建本研究克隆了来自酿酒酵母的Pir蛋白的成熟肽基因Pirl和Pir4,以及GPI型的Sedl蛋白的全基因序列,连接入毕赤酵母分泌表达载体pPIC9K中,构建3种不同的毕赤酵母细胞表面展示通用载体pKPir1、pKPir4和pKSedl,利用α-factor信号肽将蛋白引导分泌至细胞外。再以带有FLAG标签的南极假丝酵母脂肪酶B蛋白的C末端同3种锚定蛋白N端融合,并利用免疫荧光显微镜检测,证明新构建的毕赤酵母展示通用载体是成功的。蛋白电泳和Western blot初步证明了融合蛋白Sedl-CALB可被温和碱从细胞壁中抽提,进一步的证明成功的构建了毕赤酵母展示载体。3、脂肪酶CALB的定向进化本研究利用易错PCR的方法对CALB进行随机突变,利用三丁酸甘油酯乳化平板和96孔平板高通量酶活筛选的方法对约2000个酵母重组子进行筛选并得到了一株活力提高的菌株；经测序研究发现有4个氨基酸发生突变(Thr57Ala、Ala87Thr、Arg168Lys和Gly226Arg),其水解活力提高了1倍。利用生物信息学分析发现其突变位点的空间结构位于活性中心附近,可能有利于其同相关底物的结合,进而提高了其水解活性。同时,利用定靶位点区域饱和突变的方法,并基于毕赤酵母展示技术对脂肪酶CALB进行了定向进化与改造研究。在60℃下三丁酸甘油酯乳化平板对大约5000个酵母重组突变子进行了筛选并得到2株产脂肪酶热稳定性较高的菌株,测序发现其中一个突变菌株mCALB7有7个氨基酸(Pro218Asn, Leu219Lys, Phe220Thr, Val221Ser, Leu278Gly, Ala279Met和Ala281Ile)发生突变,其在60℃保温的半衰期提高了1倍。mCALB168中也有3个氨基酸(Thr57Ala、Ala87Thr和Arg168Lys)突变产生,其在60℃保温的半衰期提高了约2倍。进一步的利用其模拟的空间结构分析发现2个突变子的分别有3和4个氢键的增加,酶性质分析其原因可能是突变子热稳定性提高的一个重要原因。4、构建的毕赤酵母全细胞催化剂在非水相中合成活力的比较研究分析不同类型的锚定蛋白展示的CALB全细胞催化剂在非水相中催化合成短链脂肪酸酯,确定α凝集素展示的KNS-CALB菌株在合成活力方面的优势,并初步获得其在乙酸乙酯和丙酸乙酯合成方面优于商品化的同类型的脂肪酶。此外,还研究分析在水相中耐热性优良的突变子在有机相中的耐热稳定性,结果发现突变子的耐热性并没有显著的提高,说明定向改造的脂肪酶耐热性在水相中与有机相中并不体现一定的相关性。因此,有必要建立一种在有机相中高通量筛选耐热性突变子的方法体系,为脂肪酶在有机合成中的应用奠定基础。