腹泻性贝毒（diarrhetic shellfish poisoning, DSP）的主要成份为大田软海绵酸(OkadaicAcid，OA)和鳍藻毒素（Dinophytoxin-1，DTX-1)。当海洋中双壳贝类、螺类等滤食性生物摄食了产DSP毒素藻类后，DSP毒素经消化腺吸收蓄积体内，DSP毒素对于海产品自身并不影响，但通过食物链引起食用者中毒，出现了类似肠炎的DSP中毒症状。OA和DTX-1是同类物质，作为DSP毒素的主要致病成分，抑制磷酸酶活性，另外，OA具有强致癌性以及免疫毒性。近年来，DSP中毒事件频繁在世界范围内爆发，世界大部分海域均检出DSP毒素，对于消费者的生命安全造成严重威胁。由于DSP毒素稳定性高，目前研究表明不能通过加热煮沸的方式去除毒素，因此，预防DSP中毒至关重要。目前，全球有13个国家已制定了DSP毒素限量标准及标准检测方法，我国海产品检测主要参照欧盟的限量标准。目前常用的DSP毒素检测方法主要有：小鼠生物分析法、化学仪器法和传统免疫学分析方法等。 ELISA检测方法具有简单、快速、灵敏适宜大规模筛查的特点，应用较为广泛；而免疫层析试纸条因具有直观、快速、操作简单方面等优点，更佳适合现场初步筛选阳性样品；高效液相色谱质谱串联方法检测准确性高，结果重复性好，可用于样品的定量分析和阳性样品的验证。20世纪90年代所建立SELEX技术筛选获得的核酸适配子可以与靶物质高特异性结合，在建立小分子检测方面展现了广阔的未来，有望作为单克隆抗体替代物或与抗体联合应用于免疫学检测研究。本文在已有的抗OA单克隆抗体(与DTX-1100%交叉)基础上，建立了胶体金免疫层析试纸条(lateral flow immunochromatographic assay, LFIC)、化学发光酶免疫检测方法(micro-plate chemiluminescence enzyme immunoassay, CLEIA)和高效液相色谱-质谱串联检测方法(HPLC-MS/MS），用于主要DSP毒素的检测分析。利用所建立方法对全国各沿海城市的市售海鲜进行污染调查研究，为DSP毒素的检测管理提供了可靠数据。核酸适配子作为新兴的检测技术相对于传统的单克隆抗体具有省时、稳定和特异性强等优势。因此本实验以OA小分子毒素和OA单抗为靶标，基于磁珠SELEX技术筛选出与其特异性结合的核酸适配子，并初步建立了OA的无毒检测方法。主要DSP毒素胶体金免疫检测方法采用经典的柠檬酸三钠还原法制备了20nm胶体金，经透射电镜鉴定金颗粒分散均一，大小一致。与OA单抗孵育形成金标示踪复合物，通过三维喷膜仪固定T线和C线。优化方法的主要条件，优化后试纸条的检测范围1.6-50ng/mL，定性限50ng/mL。主要DSP毒素化学发光酶免疫分析法建立了化学发光酶免疫分析法（CLEIA）并对免疫检测程序的主要条件进行了优化，优化后参数条件为：包被量为50ng/mL，4℃孵育过夜；最佳封闭时间为120min，单抗最适稀释倍数1:200000，37℃孵育60min；HRP标记二抗最佳浓度1:5000，37℃孵育60min；加入鲁米诺底物系统缓冲液避光孵育10min。线性回归方程为：Y=59.74+12.99Ln (X)，相关系数为0.99，线性范围为0.0098ng/mL～10ng/mL，最低检出限为0.0098ng/mL。高、中、低浓度的回收率分别为97.2%、112.2%和104.7%，批内批间变异系数均小于10%。主要DSP毒素高效液相色谱质谱串联方法的建立建立了HPLC-MS/MS分析方法，优化方法的各项参数：OA的检测离子对为m/z827.7/723.7，m/z827.7/576.1； DTX-1的检测离子对为m/z841.7/737.9； m/z841.7/824.0，流动相为甲酸水和甲醇，体积比为20：80。OA和DTX-1的标准曲线方程为：Y＝1.68e3X＋3.33e3(r＝0.9995)， Y＝901X＋1.55e3(r=0.9992)；经基质校准后所得OA和DTX-1的曲线回归方程为Y＝557X－287(r＝0.9997)，Y＝288X－342(r＝0.9994)，方法最低检测限为2μg/kg。10，50和100μg/kg的平均回收率分别为63.1%，87.9%和93%，仪器精确性好变异系数仅为0.719%。沿海市售海鲜主要DSP毒素污染调查从中国的黄海、渤海、南海和东海4个海域的6个沿海城市共采集市售海鲜样品40种，利用本文所建立的三种检测方法对于采集的样品检测中14个品种的海鲜样品检出超过食用安全标准。另外，本文验证了腹泻性贝毒主要蓄积在消化腺。结果显示青岛采集的魁蚶的阳性检出率及超标率均高于其他品种的海产品。同时，从各个海域采集的蚶科以及紫贻贝均检出OA和DTX-1。由以上结果可见，中国沿海城市的市售海产品主要腹泻性贝毒污染情况严重，对消费者的生命健康安全造成了一定的潜在威胁。模拟OA抗体适配子的筛选生物合成81bp的随机ssDNA文库，文库量为1014。同时设计一段氨基修饰的固定探针，可以与文库杂交从而使文库固定在Dynal磁珠上。加入OA毒素孵育后，与OA毒素结合的核酸序列被拖拽下来，经过纯化后的ssDNA经过PCR扩增Lambda Exonuclease酶切制备次级文库用于下一轮筛选。经过15轮筛选，克隆测序获得25个核酸适配子序列。利用mfold在线分析25g适配子的二级结构，经亲和力分析获得4个优势适配子，Kd值分别为：1.71nm、0.54nm、3.96nm、2.56nm。OA抗原内影像适配子的筛选合成85bp随机ssDNA文库，将OA单抗通过氨基与苯甲磺酰基置换反应固定在Dynal磁珠上，加入文库孵育，经洗脱获得与OA单抗可结合的ssDNA，PCR扩增，Lambda Exonuclease酶切制备次级文库。经过12轮筛选，克隆测序获得40个核酸适配子序列。利用mfold在线分析4个适配子的二级结构，经亲和力分析获得4个抗原内影像适配子，其Kd分别为1.21nm0.68nm0.81nm0.95nm。运用磁珠建立OA无毒ic-ELOSA检测方法选择31号抗原内影像功能适配子，经氨基修饰包被于磁珠表面后建立OA无毒检测方法。对方法的各参数优化：适配体的包被浓度为0.5ng/mL，二抗稀释倍数为1000倍，二抗作用时间为45min。线性回归方程为Y=-0.488x+0.972R2=0.996，OA的最低检测线为0.44ng/mL，IC50为4.49ng/mL，检测范围为0.416-42.65ng/mL。特异性实验结果显示与8种海洋毒素无交叉反应。实际样品加标回收率88.3%-97.57%。采集10种市售海鲜样品进行检测，其中魁蚶、紫贻贝和栉孔扇贝OA毒素含量分别为12.83μg/kg，5.49μg/kg:和6.27μg/kg。