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【目的】通过统计分析MAP4K4在食管鳞癌中的表达情况与临床病理特征以及预后情况之间联系,进一步用体外实验揭示MAP4K4表达改变对食管鳞癌细胞增殖、凋亡水平以及迁移、侵袭能力的影响及其分子机制,探讨MAP4K4蛋白作为食管鳞癌患者靶向治疗潜在位点和预后判断的潜在价值。【方法】(1)基于生物信息学通过GEO数据库统计分析食管鳞癌中MAP4K4表达情况,提取MAP4K4数据,标准化后统计分析;收集55对食管鳞癌患者癌与癌旁正常组织,通过免疫组化的方法来检测组织中MAP4K4的表达情况,并分析MAP4K4表达量与患者临床病理特征及预后之间联系;WesternBlotting法对比检测正常食管上皮细胞系Het-1a与食管鳞癌细胞系TE-1、ECA-109中MAP4K4的表达差异;(2)在利用质粒转染HEK-293T细胞以及PEG沉淀法包装、浓缩慢病毒后,选取MAP4K4表达较高的食管鳞癌ECA-109细胞系进行慢病毒转染敲低;荧光显微镜观察阳性细胞率,用流式分选出GFP表达阳性的细胞;通过Western Blotting检测和评估敲低处理前后细胞中MAP4K4的表达改变;(3)细胞计数法及克隆形成实验分别检测敲低MAP4K4对ECA-109细胞增殖能力的影响;划痕实验及Transwell实验验证敲低MAP4K4表达对细胞迁移、侵袭能力的影响;Western Blotting揭示敲低MAP4K4后食管鳞癌细胞中MMP-2、MMP-9的表达改变;结合电离辐射处理,通过流式细胞术及Western Blotting方法检测敲低MAP4K4后ECA-109细胞凋亡变化;(4)通过Western Blotting法揭示在MAPK、NF-κB信号通路的活化及其调控增殖、侵袭与凋亡进程中敲低MAP4K4蛋白的关键作用。【结果】(1)在数据集GSE45670与GSE77861中,食管鳞癌组织中MAP4K4 mRNA的表达较正常食管组织更高(P<0.01);在55例食管鳞癌组织中,有37例(67.3%)癌组织中高表达MAP4K4,18例(32.7%)患者癌组织中呈低表达,而在配对癌旁正常组织中,32例(58.2%)MAP4K4呈阴性表达,23例(41.8%)MAP4K4呈低表达;同时,进一步分析发现MAP4K4异常高表达与食管鳞癌肿瘤的大小、淋巴结转移以及不良预后呈正相关关系,与患者其他临床病理特征无显著相关性;食管鳞癌细胞系TE-1与ECA-109细胞中MAP4K4蛋白表达显著强于食管正常上皮细胞Het-1a;(2)慢病毒转染及分选后,荧光显微镜观察显示转染阳性率高于95%;结合Western Blotting检测,选取效果较为显著的shRNA序列(P<0.05)作为后续处理条件;(3)细胞计数实验及克隆形成实验显示敲低MAP4K4后食管鳞癌细胞增殖能力减弱(P<0.05);划痕实验与Transwell实验显示敲低MAP4K4后细胞迁移、侵袭能力减弱(P<0.05);同时,Western Blotting结果显示MAP4K4的敲低也导致了侵袭相关蛋白MMP-2、MMP-9表达量的下降;在未进行放疗辐射时,敲低MAP4K4对细胞凋亡无显著影响,而结合10 Gy电离辐射处理24 h后,敲低MAP4K4的ECA-109细胞凋亡水平较对照组显著上调(P<0.05);(4)敲低MAP4K4后MAPK信号通路中Erk1/2、JNK、c-Jun磷酸化受到抑制,而p38未受明显影响;在NF-κB信号通路中MAP4K4的敲低会导致TAK1、IKKα/β、IκBα、及NF-κB(p65)的磷酸化均受到抑制。【结论】食管鳞癌中MAP4K4表达明显高于癌旁正常组织,且MAP4K4高表达与较大肿瘤体积、易淋巴结转移及患者预后不良等呈正相关关系;MAP4K4可能通过参与MAPK及NF-κB信号通路影响食管鳞癌细胞的增殖、迁移及凋亡进程。