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慢性疼痛严重影响病人的身心健康及生活质量,已成为全球性公共卫生问题。阿片类药物吗啡是目前临床上治疗慢性疼痛最有效且广泛使用的镇痛药,长期使用吗啡会引起吗啡耐受。吗啡耐受是指患者反复使用吗啡后出现镇痛效应减弱的现象,需加大用药量才能达到相同的效果,即表现药物量效曲线的右移。吗啡耐受极大地限制了其临床应用,成为疼痛治疗中的棘手问题。此前针对吗啡耐受的研究多集中在中枢神经系统,认为吗啡耐受与阿片受体下调、内化,G蛋白脱偶联持续刺激引起的神经元可塑性改变,抗阿片物质的合成增加等因素有关。但是,目前对中枢神经系统的认识并不能很好地解释吗啡耐受这种现象,而且在临床上即使应用一些针对中枢神经系统的药物与吗啡合用也不能取得很好的效果。最近的研究发现外周背根神经节初级感觉神经元在吗啡耐受和痛敏中发挥关键作用,然而具体分子机制尚不清楚。研究已经证实,肠道菌群通过神经、免疫、内分泌等多种渠道对“肠-脑轴”存在双向的调节作用,肠道菌群-肠-脑轴功能稳态失衡在多种神经系统疾病均发挥重要的作用。然而,“肠道菌群-肠-脑轴”是否在吗啡耐受中发挥作用,如何发挥作用?背根神经节是否为重要的中转站?目前仍不清楚。本课题拟从肠道菌群-肠-脑轴功能稳态失调角度来探讨吗啡耐受的新机制。本课题将围绕“肠道菌群-肠-脑轴功能稳态失调在吗啡耐受中的可能作用”这一关键科学问题展开研究。第一部分肠道菌群参与吗啡耐受的发生发展目的:（1）明确肠道菌群是否参与吗啡耐受;（2）验明吗啡耐受模型小鼠肠道菌群的变化情况;（3）验明吗啡耐受模型小鼠肠道通透性及观察菌群易位情况。方法:（1）抗生素鸡尾酒疗法建立伪无菌小鼠,观察小鼠的一般情况、自主活动能力、运动能力、基础痛阈及吗啡耐受、成瘾的表型;（2）分别收集吗啡耐受小鼠和正常对照小鼠粪便移植至伪无菌小鼠,通过行为学观察吗啡耐受表型是否经肠道微生物传递;（3）建立小鼠吗啡耐受模型,取小鼠盲肠粪便通过16S r RNA高通量测序检测肠道微生态的变化情况;（4）通过FITC-D法检测吗啡耐受模型小鼠肠道通透性,H.E.染色法观察吗啡处理对小肠粘膜形态的影响,组织细菌培养法检测肝脏、脾脏、肠系膜淋巴结处细菌易位情况。结果:（1）抗生素鸡尾酒处理去除肠道菌群建立伪无菌鼠模型可模拟无菌小鼠;（2）抗生素鸡尾酒法去除肠道菌群可以延缓小鼠吗啡耐受的发展,不影响小鼠基础痛阈、自主活动能力、运动能力、吗啡成瘾;（3）接受移植吗啡耐受小鼠粪便组较接受移植正常小鼠粪便组MPE%自D2至D6显著降低;（4）16S r RNA测序发现,慢性吗啡处理可导致肠道菌群多样性及丰度发生变化,革兰氏阳性菌比例增加;（5）H.E.染色发现吗啡耐受组小肠粘膜破坏;与对照组相比,吗啡耐受组肠道通透性增加,肠道菌群易位,这些现象可被普萘洛尔阻断。小结:肠道菌群参与吗啡耐受的发生发展。长期使用吗啡可引起肠道菌群紊乱,肠粘膜破坏,肠道通透性增加并导致肠道菌群易位。交感神经参与吗啡引起的肠道通透性增加。第二部分肠道菌群调控背根神经节炎症反应介导吗啡耐受目的:（1）探讨肠道菌群是否介导背根神经节炎症参与吗啡诱导;（2）探讨肠道菌群是否通过巨噬细胞参与吗啡诱导的背根神经节神经炎症;（3）阐明巨噬细胞介导吗啡诱导的DRG神经元超兴奋的机制。方法:（1）通过RT-PCR、免疫荧光检测巨噬细胞标记物F4/80、炎症因子、趋化因子在吗啡耐受的正常小鼠及吗啡耐受的伪无菌鼠DRG中的变化;（2）观察腹腔注射和鞘内注射氯膦酸二钠脂质体清除巨噬细胞对吗啡耐受表型的影响;（3）通过膜片钳检测清除巨噬细胞对吗啡耐受小鼠DRG兴奋性的影响。结果:（1）吗啡耐受小鼠血清IL-18浓度升高,抗生素清除肠道微生物可显著降低其升高;（2）RT-PCR、免疫荧光检测发现吗啡耐受组小鼠背根神经节中巨噬细胞浸润,抗生素清除肠道菌群可显著抑制DRG中巨噬细胞浸润;（3）吗啡耐受引起小鼠背根神经节中促炎因子表达增加,抗生素清除肠道菌群可显著抑制炎症因子表达增加;（4）采用氯膦酸二钠脂质体清除DRG中巨噬细胞可以延缓吗啡耐受的发生发展;（5）吗啡耐受导致背根神经节神经元兴奋增加,清除DRG巨噬细胞可降低吗啡导致的DRG神经元超兴奋。小结:肠道菌群参与吗啡诱发DRG中巨噬细胞浸润及神经炎症,进而引起背根神经节兴奋性增加。第三部分TLR2参与肠道菌群调控吗啡耐受及神经炎症的机制目的:（1）验明TLR2在吗啡耐受中的重要作用;（2）阐明TLR2通过肠道菌群及巨噬细胞参与吗啡耐受的机制。方法:（1）通过RT-PCR、Western Blot筛查TLRs在吗啡耐受小鼠脊髓、DRG中的表达情况;（2）观察TLR2、TLR4基因敲除鼠吗啡耐受行为学表型,干预TLR2对吗啡耐受的影响;（3）建立TLR2基因敲除鼠吗啡耐受模型,取小鼠盲肠粪便高通量测序检测肠道菌群的变化情况;RT-PCR比较正常小鼠吗啡耐受模型及伪无菌鼠吗啡耐受模型中背根神经节TLR2的表达情况;（4）免疫荧光、RT-PCR检测TLR2基因敲除鼠DRG中巨噬细胞浸润及炎症因子的表达情况。结果:（1）RT-PCR、Western Blot检测发现TLR2在吗啡耐受小鼠脊髓、背根神经节的表达显著上调,且TLR2在吗啡耐受模型背根神经节中表达增加依赖于肠道菌群;（2）敲除TLR2基因可缓解吗啡耐受,而敲除TLR4基因未能延缓吗啡耐受;（3）TLR2激动剂PGN鞘内注射可加速吗啡耐受的进程,TLR2中和抗体可延缓吗啡耐受的发展;（4）TLR2基因敲除鼠吗啡耐受模型组较对照组肠道菌群多样性降低;（5）TLR2基因敲除鼠吗啡耐受模型组与对照组比较,DRG巨噬细胞及促炎因子表达未见显著变化。小结:肠道菌群调控吗啡耐受模型背根神经节中TLR2的表达,TLR2基因调控背根神经节炎症参与吗啡耐受的发生发展。