研究目的一氧化碳(Carbon monoxide,CO)为无色、无臭、无刺激性的气体,在水中的溶解度甚低,空气混合爆炸极限为12.5%～74%。凡含碳的物质燃烧不完全时,都可产生一氧化碳,因此一氧化碳的来源广泛,如家庭用煤炉、燃气热水器和汽车发动机废气为一氧化碳常见的来源。工业生产中接触一氧化碳的作业则不下70余种,如冶金工业中炼焦、炼铁、锻冶、铸造和热处理的生产;化学工业中合成氨、丙酮、光气、甲醇的生产;矿井放炮、煤矿瓦斯爆炸事故等过程,或生产使用含一氧化碳的可燃气体。炸药或火药爆炸后的气体含一氧化碳约30%～60%。上述工业生产过程中都可能有接触一氧化碳的机会,但职业性急性一氧化碳中毒多发生于一氧化碳泄漏同时通风不良的情况下。由于一氧化碳无色无臭,泄露后不易及时发觉,急性一氧化碳中毒迄今是我国发病和死亡人数最多的急性职业中毒。一氧化碳也是许多国家包括我国北方在内的意外生活性中毒中致死人数最多的毒物。CO中毒可以造成以中枢神经系统功能损害为主的多脏器病变,其中CO中毒迟发性脑病是最常见且严重的并发症,发病率约为0.2%—47.3%,在重度CO中毒患者中可达10%-40%。部分急性一氧化碳中毒的患者,在急性期昏迷苏醒后症状完全恢复,经历2～30天的假愈期后再次出现记忆力障碍、遗忘症候群、帕金森综合征、舞蹈征、失语、失用、皮质盲、癫痫发作、幻觉、精神异常等表现,临床表现主要以痴呆为主,被称为″一氧化碳中毒迟发性脑病″。更多患者有轻微神经精神缺陷包括人格异常和认知障碍。轻度认知障碍的发生率可高达67%,纵使经过高压氧治疗后也有18%的中毒者遗留有神经精神症状。由于一氧化碳中毒迟发性脑病病程较长,治疗困难,患者常遗留有认知功能和记忆障碍等,严重影响生活质量,并给社会带来了巨大负担,成为目前临床医学的重大难题。国内外已经有很多学者对迟发性脑病的机制进行了研究,目前有很多假说譬如免疫反应或凋亡的存在可能参与了迟发型脑损害的发生,但迟发性脑病的确切的发病机制迄今尚未阐明。研究方法Wistar雄性成年大鼠144只,应用腹腔染毒的方法制造一氧化碳中毒模型,选择染毒前和染毒后1天、3天、7天、14天和28天时间点进行观察。用99.9%的一氧化碳气体进行腹腔注射,共4次,每隔4小时一次,首次剂量为100ml/Kg,其余3次剂量减半为50ml/Kg。每个时间点观察大鼠的临床表现,并行大鼠被动回避性跳台实验,记录跳台潜伏期和错误次数。生物化学方法测定血清和组织匀浆丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)含量、抗活性氧活力(anti-ROS)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、谷胱甘肽还原酶(GR);免疫组织化学染色方法观察大脑皮质和海马是否存在细胞凋亡或/和坏死的形态学变化;用Western Blotting方法分析大脑皮质和海马中凋亡相关蛋白Bc1-2、Bax和Caspase-3蛋白以及线粒体蛋白细胞色素C、神经丝蛋白(NF-H,NF-M,NF-L)含量的变化:末端脱氧核糖核苷酰转移酶(TdT)介导的标记脱氧脲核苷酸缺口末端标记法,进行凋亡细胞的检测;DNA裂解的检测是通过琼脂糖凝胶电泳测定大脑皮质和海马神经组织提取的DNA是否存在DNA Ladder。结果1.动物模型的建立腹腔染毒后5分钟,动物即出现明显的中毒反应,表现为拒食少动,行动迟缓,抽动,烦躁不安,肢端皮肤和粘膜呈明显的樱桃红色,部分大鼠出现角弓反张,震颤,继而昏迷等症状,给予通风,约7-8小时后大鼠完全苏醒,观察到第28天,大鼠的饮食和日常活动无明显异常。跳台实验测定中毒后大鼠不同时间点的记忆力的变化(包括跳台潜伏期和错误次数的记录)。2.跳台实验结果显示,与染毒前相比,染毒后大鼠记忆力明显减退,表现为跳台潜伏期缩短,错误次数增加,于染毒后第3天、7天、14天、28天最明显(P＜0.05)。3.大鼠大脑皮质、海马和血清中氧化抗氧化系统的改变3.1大脑皮质:中毒后,MDA的含量呈现一个先升高后降低的趋势。与染毒前相比,在染毒后第3天、7天、14天和28天分别升高了176%,140%,125%和113%。抗活性氧活力在第7天、14天和28天时有明显的下降;GSH-Px和GR在染毒后呈现一个缓和的下降趋势;GSH在染毒后先升高而后渐下降138%,103%,69%,63%,and 65%。3.2海马:MDA的含量呈现一个先升高后降低的趋势。与染毒前相比,染毒后第1天、3天、7天、14天和28天MDA的含量分别升高了150%,136%,127%,121%和109%。活性氧在第28天时较染毒前降低19%(P＜0.05);GSH-Px和GR在染毒后第3天时分别下降14%和22%;抗活性氧能力在第28天时较染毒前降低22%(P＜0.05);GSH的含量于第1天时先升高而后分别下降97%,75%,71%,and 71%。3.3血清:与染毒前相比,在染毒后第1天,3天,7天,14天和28天,血清MDA分别增加了162%,134%,125%,120%and 108%(P＜0.05)。抗活性氧活力在第28天时较染毒前降低10%(P＜0.05);GSH-Px和GR染毒后在血清中呈逐渐下降的趋势。GSH在血清中的变化趋势与大脑皮质和海马相同。4.免疫组织化学染色结果免疫组织化学染色发现Bc1-2在染毒后第14天和28天时大鼠大脑皮质和海马神经元胞浆和核周的表达明显下降。与对照组相比,Bax在大脑皮质和海马中的表达于染毒后第7天和第14天时明显的升高,于第28天稍有下降。Caspase-3在大脑皮质和海马中于第14天和第28天时在胞浆的表达比较明显。5.染毒后大鼠脑组织凋亡相关蛋白Bc1-2、Bax、Caspase-3和线粒体蛋白Cyt-C、含量的改变。5.1中毒大鼠脑组织中细胞凋亡相关蛋白含量的时间变化趋势5.1.1 Bc1-2:大脑皮质:与染毒前相比,大脑皮质中Bc1-2的表达呈逐渐增加的趋势,分别增加28%,37%,44%,75%,and 77%(p＜0.01);在海马中的表达而是逐渐下降的,22%,50%,59%,67%,and 70%(p＜0.01)。5.1.2 Bax:在大脑皮质中分别增加30%,49%,55%,61%,and 62%;在海马中32%,49%,47%,54%,and 52%。5.1.3 Caspase-3:在大脑皮质中13%,64%,65%,90%,and 89%;在海马中6%,25%,27%,56%,and 58%。5.2中毒后大鼠脑组织中线粒体蛋白含量的时间变化趋势Cyt-c:与对照组相比,大脑皮质中染毒后第1天和第3天分别下降了16%,43%,而后于第7天、14天和28天分别增加了42%,46%,133%。海马中与对照组相比,与染毒后第1天、3天和7天分别下降了39%,47%,20%,而后于第14天和28天分别增加了4%和20%。6.染毒后大鼠神经组织NF蛋白含量的改变6.1染毒大鼠中细胞骨架蛋白含量的时间变化趋势6.1.1大脑皮质:NF-L:与对照相比,大脑皮质上清中NF-L的含量在CO染毒后第1、3、7天时分别下降了23%、42%、36%,于第14和28天分别增加了66%和13%(P＜0.01);同时,大脑皮质沉淀中NF-L的含量在CO染毒后第1、3和7天时分别下降了48%、40%、33%、11%和15%(P＜0.01)。NF-M:与对照相比,大脑皮质上清中NF-M的含量在CO染毒后第1、3天时分别下降了1%、6%。于第7天、14天分别增加了39%和30%,于第28天有下降了26%。同时,大脑皮质沉淀中NF-M的含量在CO染毒后分别改变12%,4%,21%,6%,148%。NF-H:与对照组相比,大脑皮质上清中NF-H的含量在CO染毒后第1天先增加了14%,而后又分别降低了1%,31%,22%,和6%。同时,大脑皮质沉淀中NF-L的含量在CO染毒后14%,24%,22%,而后又增加了12%和26%。6.1.2海马NF-L:与对照相比,海马上清中NF-L的含量在CO染毒后第1、3、7天时先下降了12%,而后增加了4%,20%,65%和124%。海马沉淀中NF-L的含量分别下降了22%,16%,15%,而后增加了28%和148%。NF-M:上清先增加了19%,后下降了37%,35%,又增加了14%,和69%。沉淀中的含量先增加了40%和9%,后下降了48%,又增加36%和38%。NF-H:与对照组相比,大脑皮质上清中NF-H的含量在CO染毒后第1天先下降23%,7%,后增加15%,27%,36%。沉淀中NF-H的含量先下降5%,8%,后增加14%和44%和52%。7.TUNEL检测光镜下可见DNaseⅠ降解处理后的阳性对照和实验组,大脑皮质和海马中的细胞核呈圆形和不规则形,棕染,着色深,细胞界限不清,表明一氧化碳中毒后神经元出现DNA的断裂,并伴有3′-OH形成。8.核DNA的琼脂糖凝胶电泳中毒后大鼠大脑皮质和海马DNA没有观察到典型的180-200bp的DNALadder,梯状条带不明显,这种阴性结果并不能排除有凋亡的存在,只表明DNA的损伤相对较轻,还不至于出现DNA Ladder。结论1.一氧化碳中毒后有记忆障碍的发生,可能与迟发性脑组织损害有关。2.一氧化碳中毒引起的氧化抗氧化系统的失衡在迟发性脑损害中可能起了重要的作用。3.凋亡相关蛋白Bc1-2、gax、Caspase-3及线粒体蛋白Cyt-C的含量在一氧化碳中毒后不同时间点发生了明显的变化,表明凋亡参与了迟发性脑损害发生的机制。4.一氧化碳中毒引起的神经丝蛋白的改变可能参与了迟发性脑损害发生。