莱氏野村菌（Nomuraea rileyi）作为一种可侵染多种鳞翅目夜蛾科害虫的环境友好型虫生真菌，由于其在害虫防治方面具有重要的作用，因而受到人们的广泛关注及重视。虫生真菌的分生孢子是其作为杀虫剂的主要有效成分，但莱氏野村菌大量产孢所需的生产条件较为苛刻，限制了该菌的规模化生产及广泛应用。因此，我们课题组另辟蹊径，成功诱导出了一种可以代替传统分生孢子的侵染体结构，即一种具有抗逆性强、耐高温和耐储存等优点的微菌核。但目前有关莱氏野村菌微菌核的发育机制尚不清楚，因此本课题组进行了莱氏野村菌微菌核的比较转录组分析，以从分子层面探讨微菌核的发育机制，为微菌核的大量生产及研制高效防治夜蛾科害虫的生物制剂奠定基础。本研究从以下两个方面了进行了研究：一是氧胁迫与微菌核发育之间的关系；二是在比较转录组分析的基础上，克隆得到了一个与微菌核发育相关的基因—NADH氧化酶基因Nox，并采用RNA干扰技术对其进行了功能分析。主要研究结果如下：①通过添加外源氧化剂（H2O2，甲萘醌）和抗氧化剂（抗坏血酸）所分别造成的氧胁迫或抗氧胁迫对微菌核发育的影响，发现10-7、10-5M H2O2能够显著性地促进微菌核的分化，提高其生物量及产量；且1μM甲萘醌也能显著促进微菌核的分化，提高其产量。而不同浓度的抗坏血酸均能显著抑制微菌核的分化，尤其是当抗坏血酸添加至0.03g/L时，可完全抑制微菌核的形成。这表明，一定浓度的氧胁迫能够促进微菌核的分化。②胞内H2O2含量测定表明，在微菌核形成初期（MI）时，胞内H2O2含量最高，大约是未分化时期（UD）的3倍。这表明H2O2在微菌核发育中发挥着重要的生物学功能，即较高浓度的活性氧参与了微菌核的分化过程。③根据转录组上调基因库中NADH氧化酶的EST序列，通过RACE技术获得了Nox基因的全长序列，Genbank登录号为KF425266。Nox基因的cDNA全长为1663bp，其中开放阅读框为1233bp，编码410个氨基酸，基因组大小为1788bp，含有2个内含子。生物信息学分析表明，该蛋白理论分子量为44.81kDa，理论等电点为7.12，无信号肽和跨膜结构，定位于线粒体上，并含有一个old yellow enzyme(OYE)-related FMN binding domain (15-356aa)。同源比对和系统进化分析发现，莱氏野村菌的Nox蛋白与绿僵菌的同源性最高，约为82%；且亲缘关系最近。④RT-qPCR表达特性分析表明，Nox在微菌核发育的各时期均有表达。并在MI时期表达量最高，大约是UD期的5.6倍；随后降低，这与胞内H2O2含量的变化趋势大致相同。⑤采用酶抑制剂和RNA干扰技术进行Nox基因的功能分析表明，Nox基因与微菌核的发育有关。其中采用鱼藤酮抑制剂研究发现，40μM和100μM鱼藤酮均能显著抑制微菌核的形成，且100μM鱼藤酮使得Nox基因的mRNA表达量下降了约50%。⑥通过RT-qPCR检测干扰效率表明，500nM siRNA能够有效沉默Nox基因的表达，使其mRNA表达量下调了约57%。观察干扰Nox基因后微菌核的表型，发现500nM siRNA干扰菌株所产生的微菌核表型发生了明显变化，主要表现为：微菌核颗粒的直径变大、培养液中紫褐色色素消失、菌液黏稠度下降以及微菌核产量显著性降低，其产量下降了约98.5%。这些结果表明，Nox参与调控莱氏野村菌微菌核的发育。⑦Nox基因与胞内H2O2的产生有关。500nM siRNA干扰菌株所产生的微菌核胞内H2O2含量下降了约38%。结合上述研究结果，我们初步推测Nox基因调控莱氏野村菌微菌核发育的机制可能是：通过改变自身的转录水平，继而影响胞内H2O2的水平，从而调控微菌核的分化。⑧Nox基因还影响微菌核的毒力。分析干扰菌株对菜青虫幼虫的毒力，发现干扰菌株的半致死时间LT50显著长于野生型菌株。这表明干扰Nox基因后，莱氏野村菌微菌核的毒力下降，影响微菌核的侵染力。