近年来,中药防治肿瘤受到了人们广泛的关注。雷公藤是我国传统中药材卫矛科雷公藤属植物,它的有效成分之一——雷公藤红素,被证明具有广泛的药理学作用。临床上,雷公藤红素作为传统药物,用于治疗多种炎症疾病和自身免疫性疾病,如过敏性哮喘、肌萎缩侧索硬化症以及类风湿性关节炎等。随着研究的深入,人们逐渐发现,雷公藤红素还可以抑制多种肿瘤的发生发展,如乳腺癌、肝细胞肝癌、膀胱癌、胃癌和前列腺癌等,但在结直肠癌中的报道却非常少见。本研究的目的是系统地探究雷公藤红素对结直肠癌的作用以及其具体的分子机制。MTT和细胞克隆的实验结果表明,雷公藤红素可以显著地抑制结直肠癌细胞系SW480和HCT116细胞的生长。我们用雷公藤红素腹腔注射两种经典的结直肠癌动物模型——-C57BL/6J-ApcMin/+(APCMin/+)小鼠和AOM/DSS小鼠,结果发现雷公藤红素在小鼠体内也有明显的抑瘤作用。同时,Western blot和TUNEL的实验结果证明,雷公藤红素在体内、外可以促进细胞凋亡。此外,我们还发现雷公藤红素可以通过泛素化-蛋白酶体途径降解β-catenin,从而抑制Wnt/β-catenin信号通路的活性。面临床上,大多数患者的结直肠癌组织都存在Wnt/β-catenin信号通路的异常活化。因此,这提示我们,抑制Wnt/β-catenin信号通路可能是雷公藤红素抑制结直肠癌的机制之一。Hippo信号通路与Wnt/β-catenin信号通路有着千丝万缕的联系。Hippo信号通路是一条高度保守的信号通路,参与调控器官大小等。有研究指出,Hippo信号通路的下游主要效应分子——Yes相关蛋白(yes-associated protein,YAP)与β-catenin可以相互作用,从而调节肠道再生以及结直肠癌的发生发展。我们的研究表明,在雷公藤红素降解β-catenin的过程中,YAP存在于β-catenin降解的复合体上,并且YAP的磷酸化对β-catenin的降解至关重要。最近的文献报道,肝脏激酶1(liver kinase B1,LKB1),也被称作丝氨酸-苏氨酸激酶 11(serine-threonine kinase 11,STK11)作为抑癌基因,可以促进YAP的磷酸化,使得YAP从细胞核移至细胞浆中,最后被蛋白酶体降解。我们在SW480和HCT116细胞中利用CRISPR-Cas9体系构建了LKB1缺失的稳定细胞系。在体内,我们利用Loxp-Cre体系构建了在肠道特异性敲除LKB1的小鼠,并且用AOM/DSS诱导其发展为结直肠癌。我们用雷公藤红素处理后,结果发现LKB1的缺失不仅可以在体内外促进结直肠癌细胞的生长,还能拮抗雷公藤红素降解β-catenin,从而削弱雷公藤红素的抑瘤作用。我们进一步还发现了雷公藤红素可以上调热休克因子1(heat shock factor 1,HSF1)的表达,从而增强LKB1的转录活性。LKB1激活其下游分子——AMP活化的蛋白激酶α(AMP-activated protein kinase α,AMPKα),进一步磷酸化 YAP,从而促进了β-catenin泛素化-蛋白酶体途径的降解。综上所述,我们的研究表明,雷公藤红素通过泛素化-蛋白酶体途径降解β-catenin,从而在体内、外明显地抑制结直肠癌细胞的生长,而找到雷公藤红素降解β-catenin的具体途径是关键。我们的研究发现了其潜在的一条通路——雷公藤红素可以通过提高HSF1的蛋白水平,上调LKB1的转录活性,从而激活AMPKα,进一步磷酸化YAP。磷酸化的YAP存在于β-catenin降解的复合体上,促进β-catenin泛素化-蛋白酶体途径的降解。在此过程中,YAP和LKB1在结直肠癌发生发展和雷公藤红素抑瘤过程中起着不可或缺的作用。以上结果为雷公藤红素在临床上用于结直肠癌的治疗提供了很好的理论基础。Hippo信号通路是一条高度保守的信号通路,它参与机体组织和器官的发育过程和维持体内细胞增殖与凋亡的动态平衡,也被证明与肿瘤的发生发展有着密切的联系。Hippo信号通路的主要下游效应分子YAP,是一个转录激活因子,参与调控下游很多靶基因,而这些靶基因多与细胞的增殖与存活相关。作为癌基因,YAP可以促进细胞生长和抑制细胞凋亡。而Hippo信号通路下游的另一个主要效应分子TAZ,与YAP具有将近60%的同源性。因此,我们推测TAZ可能具有与YAP相似的生物学功能。为了验证我们的猜想,我们分别在T-Rex-293细胞和HEK293细胞中构建了 TAZ诱导表达和稳定表达的细胞系。细胞生长曲线、细胞克隆形成以及裸鼠皮下成瘤实验结果证明了,高表达TAZ可以在体内外促进细胞的生长。同时,我们还发现上调TAZ的表达可以部分逆转雷公藤红素诱导的细胞凋亡。接着,我们又找到了 TAZ抵抗细胞凋亡的可能的分子机制——诱导的TAZ高表达可以上调其下游靶基因包括ANKRD,CYR61以及CTGF,并且还可以增加Bcl-2的表达,降低Bax的表达,活化PI3K/Akt信号通路。以上发现揭示了 TAZ作为癌基因可以参与调控细胞增殖和凋亡。