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糖尿病是由于胰岛素的分泌相对或绝对不足而引起的以糖代谢紊乱为主要特征的全身性代谢疾病,为常见的内分泌疾病之一。近年来在发达国家,糖尿病已成为继心血管疾病及恶性肿瘤之后的第三大类危害人类健康的终身性疾病。糖尿病的发生与胰岛β细胞损伤和功能异常有关,而胰岛β细胞胰岛素信号转导通路障碍是糖代谢紊乱的重要原因之一。因此,研究胰岛β细胞胰岛素信号转导通路对糖尿病及其并发症的防治具有十分重要的意义。链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)是一种对胰岛细胞具有选择性破坏作用的化合物,是目前公认的用来建立糖尿病模型的药物。INS-1细胞株来源于辐射所致的胰岛β细胞瘤,与原代培养胰岛细胞相似,现被广泛用来研究胰岛β细胞的生长、凋亡、功能及细胞毒副作用等。丝胶是一种由18种氨基酸组成的高分子量水溶性蛋白,本课题组前期研究发现,丝胶可以有效降低2型糖尿病大鼠的血糖,并且用丝胶预处理能避免模型大鼠血糖的升高,而具体机制尚不明确。本研究拟采用给予小剂量STZ的方法对INS-1细胞造成损伤,探讨丝胶可否通过影响INS-1细胞胰岛素PI3K/Akt信号通路对INS-1细胞起保护作用,为丰富丝胶保护胰岛β细胞的作用提供实验数据,并为糖尿病的防治提供新思路。目的:通过观察丝胶对STZ致损伤INS-1细胞胰岛素受体(Insulin receptor,IR)、胰岛素受体底物-1(Insulin receptor substrate-1,IRS-1)、磷脂酰肌醇-3-激酶(Phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)、蛋白激酶B(Protein kinase B,Akt/PKB)、叉头框蛋白O1(Forkhead box O1,Fox O1)和B淋巴细胞瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leuke-2,Bcl-2)及其家族的促凋亡基因Bax和Bad表达的作用,探讨丝胶对STZ致损伤INS-1细胞胰岛素PI3K/Akt信号转导通路的调节作用及可能机制。方法:1.INS-1细胞随机分为5组:正常对照组(NC组)、STZ损伤组(STZ组)、丝胶保护低剂量组(LS组)、丝胶保护中剂量组(MS组)和丝胶保护高剂量组(HS组)。NC组细胞给予不含药物的完全培养基培养;STZ组细胞给予完全培养基配制的STZ溶液培养,STZ终浓度为10mmol·L-1;LS组、MS组、HS组细胞给予完全培养基配制的同时含STZ和不同浓度丝胶的溶液培养,终浓度分别为STZ 10mmol·L-1+丝胶150μg·m L-1、STZ 10mmol·L-1+丝胶300μg·m L-1、STZ 10mmol·L-1+丝胶600μg·m L-1。各组INS-1细胞用不同药物作用24h后用于实验。2.采用倒置显微镜观察各组细胞的形态学变化。3.采用CCK8法检测各组细胞活力。4.使用流式细胞仪采用Annexin V/PI双染法检测各组细胞的凋亡情况。5.采用Western Blotting法检测各组细胞IR、IRS-1、PI3K、Akt、P-Akt、Fox O1、Bcl-2、Bax、Bad蛋白的表达。6.釆用实时荧光定量PCR(Real Time PCR)法检测各组细胞IR、IRS-1、PI3K、Akt、Fox O1、Bcl-2、Bax、Bad mRNA的表达。结果:1.各组INS-1细胞的形态:NC组,INS-1细胞数量较多,单层生长,分布均匀,呈不规则多边形,细胞有连接融合倾向;STZ组,经STZ处理后,INS-1细胞间隙增宽,出现漂浮、脱落现象,贴壁细胞数量减少,细胞形态发生改变:细胞变圆,体积变小;与STZ组相比,LS、MS、HS组,细胞间隙变窄,漂浮、脱落细胞减少,细胞形态趋于正常。2.各组INS-1细胞的活力:NC组INS-1细胞活力为(100±0)%,STZ组细胞活力为(53.83±5.76)%,明显低于NC组(P<0.05);LS组、MS组、HS组细胞活力分别为(63.53±4.30)%、(71.55±3.13)%、(82.31±5.11)%,均明显高于STZ组(P<0.05);且LS、MS、HS三组INS-1细胞活力两两比较,差异有统计学意义(P<0.05)。NC组INS-1细胞早期凋亡率为(5.10±1.64)%,STZ组细胞早期凋亡率为(13.73±1.56)%,明显高于NC组(P<0.05);LS组、MS组、HS组细胞早期凋亡率分别为(10.74±1.64)%、(8.57±1.60)%、(7.12±1.56)%,均明显低于STZ组(P<0.05);且HS组INS-1细胞早期凋亡率明显低于LS组(P<0.05)。4.各组INS-1细胞IR的表达:与NC组比较,STZ组INS-1细胞IR蛋白及mRNA的表达明显降低(P<0.05);与STZ组比较,LS组、MS组、HS组细胞IR蛋白及mRNA的表达明显升高(P<0.05);并且,LS、MS、HS三组INS-1细胞IR蛋白表达两两比较,差异有统计学意义(P<0.05),HS组INS-1细胞IR mRNA的表达明显高于LS、MS组(P<0.05)。5.各组INS-1细胞IRS-1的表达:与NC组比较,STZ组INS-1细胞IRS-1蛋白及mRNA的表达明显降低(P<0.05);与STZ组比较,LS组、MS组、HS组细胞IRS-1蛋白及mRNA的表达明显升高(P<0.05);并且,LS、MS、HS三组INS-1细胞IRS-1蛋白表达两两比较,差异有统计学意义(P<0.05),HS组INS-1细胞IRS-1 mRNA的表达明显高于LS组(P<0.05)。6.各组INS-1细胞PI3K的表达:与NC组比较,STZ组INS-1细胞PI3K蛋白及mRNA的表达明显降低(P<0.05);与STZ组比较,LS组、MS组、HS组细胞PI3K蛋白及mRNA的表达明显升高(P<0.05);且LS、MS、HS三组INS-1细胞PI3K蛋白及mRNA表达两两比较,差异有统计学意义(P<0.05)。7.各组INS-1细胞Akt和P-Akt的表达:各组INS-1细胞Akt蛋白及mRNA的表达水平比较,差异无统计学意义(P>0.05)。与NC组比较,STZ组INS-1细胞P-Akt蛋白的表达明显降低(P<0.05);与STZ组比较,LS组、MS组、HS组细胞P-Akt蛋白表达明显升高(P<0.05);且LS、MS、HS三组INS-1细胞P-Akt蛋白表达两两比较,差异有统计学意义(P<0.05)。8.各组INS-1细胞Fox O1的表达:与NC组比较,STZ组INS-1细胞Fox O1蛋白及mRNA的表达明显升高(P<0.05);与STZ组比较,LS组、MS组、HS组细胞Fox O1蛋白3.各组INS-1细胞的凋亡情况:及mRNA的表达明显降低(P<0.05);且LS、MS、HS三组INS-1细胞Fox O1蛋白表达两两比较,差异有统计学意义(P<0.05),HS组INS-1细胞Fox O1 mRNA表达明显低于LS组(P<0.05)。9.各组INS-1细胞Bcl-2的表达:与NC组比较,STZ组INS-1细胞Bcl-2蛋白及mRNA的表达明显降低(P<0.05);与STZ组比较,LS组、MS组、HS组细胞Bcl-2蛋白及mRNA的表达明显升高(P<0.05);且LS、MS、HS三组INS-1细胞Bcl-2蛋白表达两两比较,差异有统计学意义(P<0.05)。10.各组INS-1细胞Bax的表达:与NC组比较,STZ组INS-1细胞Bax蛋白及mRNA的表达明显升高(P<0.05);与STZ组比较,LS组、MS组、HS组细胞Bax蛋白及mRNA的表达明显降低(P<0.05);且LS、MS、HS三组INS-1细胞Bax蛋白表达两两比较,差异有统计学意义(P<0.05),HS组INS-1细胞Bax mRNA表达明显低于LS组(P<0.05)。11.各组INS-1细胞Bad的表达:与NC组比较,STZ组INS-1细胞Bax蛋白及mRNA的表达明显升高(P<0.05);与STZ组比较,LS组、MS组、HS组细胞Bax蛋白及mRNA的表达明显降低(P<0.05);且LS、MS、HS三组INS-1细胞Bad蛋白表达两两比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:丝胶可通过调节STZ致损伤INS-1细胞胰岛素PI3K/Akt信号转导通路影响凋亡相关因子的表达,抑制INS-1细胞凋亡,且呈一定的剂量依赖性。这可能是丝胶降血糖的作用机制之一。