卵巢癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤之一,其发病率居第三位,病死率居第一位。我国卵巢癌发病率在过去的十年增长了 30%,死亡率增长了 18%。由于卵巢癌位置深在,早期症状不明显,早期筛查及诊断手段不足,超过七成的患者在疾病晚期才去就诊;又由于卵巢癌恶性程度相对较高,易转移,易耐药,易复发,5年复发率约70%,5年生存率只有39%。因此,明确卵巢癌,尤其是高级别浆液性卵巢癌(High Grade Serous Ovarian Cancer,HGSOC)的发生发展机制,筛选早期诊断标记物及治疗靶点成为亟待解决的问题。HMGA1/2(High Mobility Group A 1/2)是一个在核内表达的非组蛋白类的蛋白家族。HMGA1/2蛋白均存在AT-hook结构域,结合到DNA双螺旋的小沟中,从而改变染色质构象,起到调控作用。HMGA1/2在胚胎期及干细胞内高表达,成年后表达普遍较低,但在恶性肿瘤中又异常高表达。作为卵巢癌中重要的癌基因家族,HMGA1/2在肿瘤中高表达的机制仍未完全阐明,而HMGA1的假基因的发现为此提供了新思路。假基因是一类与亲本基因相似度较高但失去蛋白编码功能的基因。因此,很长时间以来假基因一直被认为是基因组中的“垃圾DNA”,但近几年的研究发现假基因具有重要的生物学功能,如假基因可与功能基因竞争性结合miRNA而调控功能基因的表达;假基因可以产生反义RNA抑制功能基因的表达;有的假基因还能够编码有功能的蛋白。假基因在包括肿瘤在内的疾病中表达异常并发挥了重要作用,假基因PTENP1通过竞争性结合miRNA保护PTEN的表达从而抑制肿瘤生长,假基因Oct4-pg1编码359个氨基酸的蛋白质,可促进肿瘤细胞的增殖。HMGA1P6是HMGA1的8个假基因之一,位于13号染色体,它在终止密码子处发生了突变所以产生了不能编码蛋白的RNA即长链非编码RNA。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一类转录本长度超过200个碱基的RNA分子,它们不编码蛋白。测序结果表明,人类基因组超过90%被转录,但只有1%-2%是编码蛋白基因。人们对数量庞大的非编码RNA知之甚少。近些年的研究发现,它们虽然不编码蛋白,但以RNA的形式行使多种功能。有研究发现,HMGA1P6在垂体瘤、甲状腺癌中发挥了促癌作用。但HMGA1P6是否在卵巢癌中发挥作用仍未知。本研究主要分为以下三部分:第一部分:HMGA1P6在浆液性卵巢癌中的表达、临床意义及生物学功能研究目的明确假基因HMGA1P6在卵巢癌中的表达情况,其与临床信息的相关性及其生物学功能。方法首先,利用转录组表达谱芯片,以输卵管伞作为对照,对低级别和高级别浆液性癌进行假基因表达谱分析,从中筛选差异表达假基因并分析假基因表达模式。其次,利用慢病毒构建HMGA1 P6稳定过表达及敲低细胞系,以此来研究HMGA1P6的生物学功能。最后,通过EdU掺入实验、平板克隆形成实验和MTT生长曲线探究HMGA1P6对卵巢癌细胞体外增殖的影响;裸鼠皮下成瘤实验被用来观察HMGA1P6对卵巢癌体内增殖的影响;3D成球实验和干细胞marker检测验证HMGA1P6对肿瘤细胞恶性程度的影响;Transwell实验和高内涵明场迁移实验及EMT相关marker的验证检测HMGA1P6对细胞侵袭迁移的作用;Seahorse细胞代谢实验及ATP检测实验探究HMGA1P6对肿瘤细胞代谢的影响;流式细胞术检测HMGA1P6对细胞凋亡的作用。结果1、HMGA1P6在浆液性卵巢癌中高表达并与不良预后相关通过转录组表达谱芯片对卵巢癌中的假基因进行分析,发现有577个差异表达(log2 fold change>1或<-1)的假基因,其中大部分(538 of577)差异表达的假基因在卵巢癌中表达上调。聚类及相关性矩阵分析发现高级别浆液性癌有独特的假基因表达模式。对差异表达的假基因进行筛选和验证,结果显示HMGA1P6在HGSOC中高表达并与患者不良预后相关。2、HMGA1P6促进卵巢癌细胞增殖及体内成瘤利用建立的HMGA1P6过表达及敲低细胞系,进行EdU、克隆形成及MTT实验。结果表明,过表达HMGA1P6的卵巢癌克隆形成能力更强、增殖更快,而敲低HMGA1P6后与对照相比克隆形成能力降低,细胞增殖变慢。裸鼠皮下成瘤实验结果证明,过表达HMGA1P6的卵巢癌细胞体内成瘤率更高,免疫组化中结果显示HMGA1P6过表达组的肿瘤组织中HMGA1及Ki-67的表达显著高于对照组。反之,敲低HMGA1P6后细胞成瘤能力则显著低于对照细胞。3、HMGA1P6过表达促进卵巢癌细胞的3D成球能力三维培养更能模拟体内细胞的微环境,利用建立的HMGA1P6过表达及敲低细胞系进行三维培养实验。实验显示,过表达HMGA1P6的卵巢癌细胞3D成球率更高,而敲低HMGA1P6后细胞与对照相比成球效率显著降低。干细胞marker表达水平也随HMGA1P6的敲低而降低。4、HMGA1P6促进卵巢癌细胞侵袭迁移Transwell实验显示过表达HMGA 1P6后细胞侵袭能力增强,而敲低HMGA1P6后细胞侵袭能力减弱。同时,EMT marker也显示相应变化,过表达HMGA1P6后细胞向间质转变,而敲低HMGA1P6后细胞向上皮方向转变。高内涵明场迁移实验显示敲低HMGA1P6后细胞位移减小,说明细胞迁移运动减弱。5、HMGA1P6提升卵巢癌细胞的代谢水平使用Seahorse技术检测HMGA1P6对肿瘤细胞代谢的影响,结果显示,过表达HMGA1P6后细胞整体代谢表型转向活跃状态,敲低HMGA1P6后细胞转向静默状态。此外,过表达HMGA1P6后细胞糖酵解功能增强,敲低HMGA1P6后细胞糖酵解功能减弱,且ATP水平也比对照细胞显著降低。6、敲低HMGA1P6促进卵巢癌细胞凋亡利用 Tet-On 系统敲低 HMGA1P6,DOX 诱导 48-72 h 后,Annexin V-PE/7-AAD染色流式细胞术检测细胞凋亡,结果显示,敲低HMGA1P6后细胞凋亡显著增多,western blot显示敲低HMGA1P6的HEY和SKOV3细胞的凋亡率显著提高;Bax表达升高、Bcl-2表达降低,裂解的Caspase-3增多。提示敲低HMGA1P6促进卵巢癌细胞凋亡。第二部分:HMGA1P6通过ceRNA机制调控HMGA1/2的表达目的第一部分我们已经明确了卵巢癌中HMGA1P6高表达且与促进卵巢癌恶性行为,本部分我们试图探究HMGA1P6发挥促癌作用的机制。方法部分假基因可转录形成lncRNA,通过竞争性结合microRNA从而保护亲本mRNA(competing endogenous RNA,ceRNA),为探究 HMGA1P6 是否通过此机制作用,我们进行了如下实验,首先验证HMGA1P6、HMGA1/2之间表达相关性,并进行序列比对。其次,核质分离实验确定HMGA1P6定位,转染microRNA mimics 及 inhibitors 验证 microRNA 对 HMGA1P6、HMGA1/2 的表达调控作用;构建HMGA1/2-3’UTR表达载体及双荧光素酶报告载体,构建HMGA1P6野生型及microRNA结合位点突变型双荧光素酶报告载体,利用双荧光素酶报告实验验证microRNA与HMGA1P6、HMGA1/2是否存在直接结合关系;共转染实验验证三者之间是否存在ceRNA保护网络;RIP实验、RNA pull-down实验验证HMGA1P6与microRNA是否存在结合关系。最后,拯救实验验证HMGA1P6与HMGA1的上下游关系。结果1、HMGA1P6在卵巢癌细胞中调控HMGA1/2的表达为探究HMGA1P6促进卵巢癌恶性行为的机制,我们猜测HMGA1P6可能调控HMGA1/2的表达。在卵巢癌细胞中敲低HMGA1P6后检测HMGA1及HMGA2的表达,结果显示,HMGA1和HMGA2的mRNA和蛋白水平均显著降低。进一步在HO8910细胞中以浓度梯度转染HMGA1P6,发现HMGA1及HMGA2的表达也呈现浓度梯度变化。分析卵巢癌TCGA数据显示HMGA1及HMGA2在卵巢癌中高表达;qPCR检测20例卵巢癌患者样本中HMGA1P6及HMGA1/2表达,热图分析发现三者具有良好的相关性。以上结果说明HMGA1P6在卵巢癌细胞中正调控HMGA1/2的表达。2、HMGA1P6通过ceRNA机制调控HMGA1/2的表达为深入探讨HMGA1P6的生物学功能,我们接下来先分析HMGA1P6在细胞内的定位,核质分离实验发现HMGA1P6在细胞核及细胞质内均有表达。随后,TargetScan筛选及序列比对发现靶向结合HMGA1/2的microRNA同样在HMGA1P6上有结合位点。选择可同时靶向三者的microRNA(hsa-let-7c-5p,hsa-miR-106a-5p 及 hsa-miR-103a-3p)mimics 转染卵巢癌细胞,发现这 3 个microRNA可显著下调HMGA1P6,HMGA1/2的表达;转染3个microRNA的抑制剂则可上调HMGA1P6,HMGA1/2的表达。进一步luciferase实验证实hsa-let-7c-5p,hsa-miR-106a-5p 及 hsa-miR-103a-3p 降低 HMGA1/2-3,UTR 和HMGA1P6的荧光素酶活性。为确证HMGA1P6与HMGA1/2之间的调控关系,在卵巢癌细胞中敲低HMGA1,发现HMGA1P6及HMGA2表达随之降低;过表达HMGA1-3’UTR时,HMGA1P6及HMGA2表达随之升高。敲低或过表达HMGA2后,HMGA1P6及HMGA1的表达也相应变化。共转染拯救实验也进一步验证了三者之间互为ceRNA的调控关系。最后,利用RIP及RNA pull-down实验证明HMGA1P6与miRNA及AG02蛋白结合。以上结果说明,HMGA1P6通过ceRNA机制调控HMGA1/2的表达。3、HMGA1参与HMGA1P6对卵巢癌细胞侵袭力的促进为了探究HMGA1P6调控HMGA1的生物学意义,我们进行了拯救实验。在过表达HMGA1P6的卵巢癌细胞同时敲低HMGA1,Transwell实验结果显示在过表达HMGA1P6但敲低HMGA1后细胞侵袭能力显著降低。第三部分:MYC转录激活卵集癌细胞中HMGA1P6的表达目的探究HMGA1P6在卵巢癌中过表达的上游调控机制。方法首先,生物信息学分析HMGA1P6启动子区转录因子结合位点。其次,利用ChIP、Luciferase实验证明转录因子与启动子区的结合关系。最后,验证表达调控关系。结果1、MYC结合HMGA1P6启动子区域并调控其转录活性为阐明HMGA1P6在卵巢癌中高表达的机制,利用JASPAR对HMGA1P6上游序列分析发现MYC在HMGA1P6启动子区有2个结合位点,而且MYC在卵巢癌组织和细胞系中普遍高表达。ChIP实验结果显示与同型对照相比,MYC-ChIP组对HMGA1P6启动子片段富集丰度较高,但仅通过位点2结合;Luciferase实验显示MYC过表达仅可激活野生型HMGA1P6启动子区域荧光素酶活性,敲低MYC仅可抑制野生型HMGA1P6启动子区域荧光素酶活性。以上实验说明MYC结合HMGA1P6启动子区域并调控其转录活性。2、MYC在卵巢癌细胞中调控HMGA1P6及HMGA1/2的表达为确证卵巢癌中MYC对HMGA1P6的转录调控,课题组建立了 MYC过表达和敲低细胞系,检测HMGA1P6及HMGA1/2的表达。结果显示,过表达MYC的卵巢癌细胞中HMGA1P6、HMGA1/2表达均升高,而敲低MYC后三者表达均降低。这进一步确证了 MYC在卵巢癌细胞中对HMGA1P6的转录调控。结论1、HMGA1P6在浆液性卵巢癌中高表达并与患者不良预后相关;2、HMGA1P6异常高表达促进卵巢癌增殖、侵袭迁移等恶性行为;3、HMGA1P6通过ceRNA机制调控HMGA1/2的表达;4、MYC转录激活卵巢癌细胞中HMGA1P6的表达。