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脑血管疾病是目前严重危害人类健康的主要疾病之一,其中缺血性脑血管病疾病占60%～80%,寻找有效的治疗手段并阐释其机理仍然是目前脑科学领域的研究热点,关于其机理研究方面近几年脑可塑性尤其突触可塑性成为了研究重点,对针刺促进脑血管病的恢复机制研究提供了很多依据。星形胶质细胞的研究在近几年也取得很多可喜的结果,星形胶质细胞不但自身具有可塑性,而且这种变化是与其功能相适应的,主要是配合神经元的突触活动,不同程度地调节突触可塑性。因此我们通过研究突触可塑性与星形胶质细胞功能变化的相关性以及针刺的干预作用来进一步阐明针刺治疗脑缺血的确切途径和机制。本文从以下几个方面进行了研究。1.文献研究本部分就古代中医学关于中风的命名,缺血中风的病因病机以及针灸治疗中风的古代记述方面进行了论述,从而对中风的古文献研究背景有了深入的认识。近年来在脑血管病的研究中发现卒中后恢复的不同阶段,大脑功能和组织结构可以发生一定的自我修复和重建能力,本文就近几年缺血后脑可塑性以及针刺干预作用的研究,星形胶质细胞及其在缺血后的反应变化进行了综述,为进一步研究针刺治疗脑缺血的机制奠定了理论基础。2.实验研究目的:本研究观察了脑缺血后不同时间段的突触超微结构的变化,星形胶质细胞缝隙连接蛋白、谷氨酸转运体表达的动态变化,并探讨针刺督脉“百会”“大椎”干预其变化的时效关系。方法:(1)本实验选用90只Wistar大鼠分为假手术组、模型组和电针组三组,每组又分为1h、1d、3d、1周、3周五个时间段进行观察。动物模型延用以往的电凝大脑中动脉法,造成局灶性脑缺血模型。其中假手术者只作手术暴露大鼠大脑中动脉,不予凝闭,模型组造成局灶性脑缺血模型,电针组造模后立即给予针刺治疗。电针组选取督脉经穴百会(GV20)、大椎(GV14)两穴进行针刺,针刺后接电针30min。(2)神经运动功能评分及病理形态学观察:神经运动功能体征的观察引用Berderson和Belayev等的方法进行神经功能评分,于术后1d、3d、1周、3周根据瘫痪肢体运动等的情况,按照0-4分进行评定,评分越高,损伤越重。假手术组、模型组和电针组三组大鼠于1h、1d、3d、1周、3周五个时间段组取材进行HE染色观察大脑皮质缺血区病理学改变。(3)突触的超微结构:1h、1d、3d、1周和3周后,随机取15组大鼠每组各3只左心室灌注取材,参数的观察采用JEM-1200EX透射电镜,底片放大1.5万倍印相,进行电镜观察缺血区大脑皮层突触的结构、数密度、面密度的变化规律以及突触界面参数PSD、间隙宽度和界面曲率的变化规律及电针对其的影响。(4)星形胶质细胞缝隙连接蛋白CX43及其mRNA表达:90只大鼠于术后1h、1d、3d、1周、3周每个时间段分别左心室灌注取材后,采用免疫组化和原位杂交的方法检测星形胶质细胞缝隙连接蛋白CX43及其mRNA表达。(5)星形胶质细胞谷氨酸转运体GLT-1及其mRNA表达:90只大鼠于术后1h、1d、3d、1周、3周每个时间段分别左心室灌注取材后,采用免疫组化和原位杂交的方法检测星形胶质细胞谷氨酸转运体GLT-1及mRNA表达。(6)突触超微结构与星形胶质细胞CX43、GLT-1相关性分析:运用统计学软件Stata10.0,对1h、1d、3d、1周、3周模型组、电针组的突触数密度、突触致密物厚度PSD、星形胶质细胞CX43、星形胶质细胞GLT-1进行同组、同时间段多变量之间的典型相关分析。结果:(1)神经运动功能评分模型组与针刺组出现不同程度神经缺损体征,1d,模型组和电针组多数为2分,大鼠多表现为一侧前肢内旋或内收,侧向挤压时损伤对侧肌力下降,部分可以转圈行走或偶尔转圈行走,随着脑缺血时间的延长,模型组从1d至3d神经功能评分增加,功能障碍程度加重,大鼠活动减少,1周、3周逐渐降低,从1d至3周与假手术组比较,差异均有显著性或非常显著性意义(P＜0.001,P＜0.05),电针组神经功能障碍随脑损伤时间延长而降低,神经功能恢复明显,从3d至3周电针组与模型组评分比较,差异均有显著性或非常显著性意义(P＜0.05,P＜0.01)。(2)突触的超微结构缺血损伤从早期就已对大脑皮层的突触造成了损伤,突触结构发生破坏,模型组于1h、1d、3d数密度、面密度显著性下降(P＜0.001,与同时间段假手术组比较),至1周有所提高,3周仍与假手术组有显著性差异(P＜0.01);电针组数密度、面密度于1天较模型组显著性升高(P＜0.01),3天、1周仍显著性高于模型组(P＜0.001)。PSD厚度模型组于各时段均下降(P＜0.05,与同时间段假手术组比较),而电针组于各时段均与假手术组差异无显著性意义(P＞0.05),电针组与模型组比较,差异均有显著性或非常显著性意义(P＜0.05,P＜0.01)。突触间隙宽度模型组1h组、1d组、3d组下降明显,与假手术组比较,差异均有显著性或非常显著性意义(P＜0.05,P＜0.01)。突触间隙宽度电针1h组下降明显,与假手术组比较,差异有显著性意义(P＜0.05),1d组已与假手术组无差别(P＞0.05),1周组、3周组反而高于假手术组,差异均有显著性或非常显著性意义(P＜0.05,P＜0.01)。电针3d组、1周组、3周组与模型组比较,差异均有显著性或非常显著性意义(P＜0.05,P＜0.01)。突触的界面曲率模型组1d组、3d组、1周组、3周组均下降明显,与假手术组比较,差异均有显著性或非常显著性意义(P＜0.05,P＜0.01)。电针组自1d也开始下降,但各时间段组均无模型组下降明显,与模型组比较,差异有显著性或非常显著性意义(P＜0.05,P＜0.01)。(3)星形胶质细胞缝隙连接蛋白CX43及其mRNA表达免疫组化结果显示模型组CX43于1h无明显变化,于1d开始降低,与假手术组比较差异有非常显著性意义(P＜0.001),至3d下降最明显,1周仍未恢复,与假手术组比较差异有非常显著性意义(P＜0.001)。电针组CX43于1d始下降明显(P＜0.01,与假手术组比较),于3d、1周均有下降,但较模型组表达高,与模型组比较,差异均有显著性或非常显著性意义(P＜0.05,P＜0.01)。原位杂交结果显示模型组、电针组于1h、1d与假手术组比较,差别无显著性意义(P＞0.05),于3d、1周均下降明显(P＜0.001,与同时间段假手术组比较),但电针组较模型组表达为高(P＜0.01,与模型组3d、1周组比较)。(4)星形胶质细胞谷氨酸转运体GLT-1及其mRNA表达:免疫组化结果显示模型组GLT-1的表达于1h即开始下降,至1d、3d下降最明显,与假手术组比较,差异均有非常显著性意义(P＜0.001),1周有所恢复,但与假手术组比较差异仍有非常显著性意义(P＜0.001)。电针组GLT-1的表达于1d开始下降,但较模型组下降为轻(P＜0.001,与假手术组比较;P＜0.001,与模型组比较),至3d有所恢复,较模型组表达明显增强(P＜0.001,与同时间段模型组比较)。原位杂交结果显示模型组、电针组GLT-1mRNA的表达均于1d开始下降,模型组、电针组与假手术组比较差异有非常显著性或显著性意义(P＜0.001,P＜0.05),但电针组较模型组下降为轻(P＜0.05,与同时间段缺血模型组比较),3天两组下降最明显,1周两组表达均上升,电针组与假手术组比较差别已无显著性意义(P＞0.05),与模型组比较差别有非常显著性意义(P＜0.01)。(5)突触超微结构与星形胶质细胞CX43、GLT-1相关性分析:脑缺血模型组1h突触数密度与GLT-1、1d突触致密物厚度与GLT-1、3d数密度与CX43具有相关性;3周,突触数密度、突触致密物厚度与CX43、GLT-1均具有相关性。脑缺血后施与电针治疗1h、1周,数密度、PSD与CX43、GLT-1均具有相关性;3d,数密度、PSD与GLT-1具有相关性;3周,数密度与CX43具有相关性。结论:(1)通过神经功能评分的观察说明本次实验造模是成功的,且提示电针对脑缺血大鼠的神经缺损症状有明显改善促进作用。(2)局灶性脑缺血后从早期开始随着缺血时间的延长,突触结构发生破坏,突触数量、面积下降,突触界面参数突触致密物厚度、突触间隙宽度和突触界面曲率随着时间发生动态变化。针刺从早期即可以从突触数密度、面密度和突触界面参数方面促进突触可塑性的形成。(3)脑缺血可以导致缺血早期缝隙连接蛋白表达的下降,此下降程度以3d最严重,缝隙连接蛋白Cx43及其mRNA表达量的下降是脑缺血进一步加重的机制之一。针刺从早期即可以增加星形胶质细胞的缝隙连接蛋白Cx43及其mRNA的表达,从而为突触的修复提供了环境、物质基础。(4)脑缺血后星形胶质细胞谷氨酸转运体6LT-1及其mRNA表达量下降,多数指标从早期(1d)发生改变,3d变化最明显,说明星形胶质细胞的GLT-1表达的下降导致突触间隙谷氨酸重摄取降低,是谷氨酸积聚的原因之一。针刺从早期即可以增加星形胶质细胞的谷氨酸转运体6LT-1及其mRNA的表达,对神经元突触状态的维持和功能的行使起着关键作用。(5)脑缺血后不同的时间段,星形胶质细胞CX43、GLT-1的变化与突触超微结构的变化具有相关性,星形胶质细胞与突触的相互作用是脑缺血后加重的机制之一。电针治疗后,星形胶质细胞CX43、GLT-1的变化与突触超微结构的变化仍具有相关性,电针治疗脑缺血后的修复是通过星形胶质细胞与突触的相互作用的结果,星形胶质细胞促进突触可塑性是针刺治疗脑缺血的机制之一。综上所述,我们初步认为针刺启动神经—胶质网络调节,促进突触重建是其治疗脑缺血的关键作用机制之一。