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通过酶法将天然纤维素水解成葡萄糖的过程中,必须依靠内切型-β-葡聚糖酶、外切型-β-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶三种组分的协同作用才能把纤维素分子降解成葡萄糖。内切葡聚糖酶作用于纤维素长链分子的内部,将长纤维切成短纤维,外切葡聚糖酶作用于纤维素分子的一端,以两个葡萄糖残基为单位进行切割生成纤维糊精和纤维二糖,β-葡萄糖苷酶切割纤维二糖生成葡萄糖。β- 1, 4 -内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶协同作用可将纤维素分解为小分子的纤维二糖,最终被β-葡萄糖苷酶转化为葡萄糖,因此前两者在纤维素降解中起到至关重要的作用。为了提高β- 1, 4 -内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的活力,论文从黑曲霉菌株中克隆和表达了这两种纤维素酶。主要结果如下:参考Genebank中黑曲霉内切葡聚糖酶egA基因序列设计引物,TA克隆后发现基因内部含有五段内含子,设计五条引物通过PCR方法去除内含子。设计两端含有EcoRⅠ和XbaⅠ酶切位点的上下游引物,经过双酶切、连接,构建了黑曲霉内切葡聚糖酶表达质粒pPICZαA-Aeng。使用限制性内切酶BstⅠ线性化表达质粒pPICZαA-Aeng,并采用电转化法转化巴斯德毕赤酵母感受态细胞GS115,利用梯度抗生素平板筛选转化子,获得了抗500μg/ml Zeocin的高拷贝数毕赤酵母转化子。通过刚果红平板初筛和摇瓶诱导培养复筛,筛选出2株表达量较高的重组酵母,摇瓶诱导表达结果表明内切葡聚糖酶基因在毕赤酵母中实现了表达。通过PCR从黑曲霉中分离得到一个表达β-1,4外切葡聚糖酶的基因,命名为CBH II,全长1548bp。其表达蛋白序列和一个已知由cbhB基因编码的纤维素酶序列同源性达到96.69%,蛋白分子量为67KDa左右。基因CBH II与pPICZαA载体连接并在巴斯德毕赤酵母中表达。论文实现了基因CBH II在巴斯德毕赤酵母中表达。酶学性质分析表明该酶的最适反应温度为60℃,最适反应pH为6.6,在较广的温度及pH范围内均具有较好的稳定性。