中医中药是我国的传统医学,长期实践和研究表明,其在临床治疗上有着独特的疗效。自马兜铃酸事件发生以来,中药安全性问题引起了国际上的广泛关注,严重制约了中药国际化发展进程。中药毒副作用是伴随着中药疗效同时出现的,最早从《神农本草经》开始就将中药分为上、中、下三品,其中下品治病,有毒者多,不可长期服用。常用的有毒中药大致可分为5类,即生物碱类、毒苷类、毒性蛋白类、动物类和矿物类,其中毒苷类又可分为强心苷类、皂苷类和氰苷类。为了保证中药使用的安全性,对中药中有毒物质需要制定限量标准。论文以氰苷类有毒中药为出发点进行研究,氰苷是由氰醇衍生物的羟基和糖缩合形成的糖苷,不仅是该类有毒中药中的有毒成分,也是其有效成分。苦杏仁苷为氰苷类化合物的代表,也是常用中药材苦杏仁、桃仁、郁李仁的有效成分,苦杏仁苷主要通过体内酶解生成氢氰酸而产生药理活性,小剂量氢氰酸可以镇咳平喘,但大剂量会导致中毒。中国药典2015版一部中规定,苦杏仁中苦杏仁苷含量不得少于3.0%,药典中收载的含有苦杏仁的中成药有66种,其中葶贝胶囊中具体规定了每粒胶囊(0.35 g)中的苦杏仁苷含量不得少于0.55 mg,但对于同时作为内源性毒性成分的苦杏仁苷而言,其安全限量尚属空白。论文致力于氰苷类中成药中苦杏仁苷的限量标准研究。中成药中的苦杏仁苷一般以一对差向异构体的形式存在,命名为D-苦杏仁苷和L-苦杏仁苷,在一定的条件下可以相互转化。D-苦杏仁苷为天然存在形式具有明确的药理活性,而L-苦杏仁苷的活性机制未见报道。所以探讨了D-和L-苦杏仁体外转化过程和酶解产毒差异,针对中成药中的苦杏仁苷的存在形式、含量、转化规律以及毒性代谢产物氢氰酸检测等问题开展了深入研究,为此类中成药中苦杏仁苷安全限量的制定提供科学依据。全文共分为四章。第一章为前言,首先对中药的发展现状和国际化进程做了简要的介绍,随着中药不良反应事件的频发,安全性问题已成为中药发展亟待解决的关键性问题,因此对目前已有的有毒物质评价机制进行了概述。其次主要介绍了氰苷类有毒中药的种类、分布、结构、体内代谢过程以及产毒机制等背景研究,由于氰苷类本身既是有效成分也是有毒成分,所以对于中成药中氰苷的含量测定显得尤为重要。故以苦杏仁苷为代表,分别对其原型和代谢产物HCN的检测方法进行归纳总结,为进一步的研究提供参考依据。最后提出本论文的立题依据和主要的研究内容。第二章,基于苦杏仁苷异构体的体外酶解过程,初步评估D-和L-苦杏仁苷的活性差异。首先系统研究了苦杏仁苷天然存在的D型结构向L型转化的影响因素,运用半制备液相色谱技术获得L-苦杏仁苷对照品,并对其结构进行了鉴定和确证,在得到l-苦杏仁苷对照品的基础上,研究了d-和l-苦杏仁苷体外酶解规律。结果表明碱性条件是苦杏仁苷异构化的重要因素之一,d-苦杏仁苷在ph11的naoh溶液中静置30分钟为转化生成l-苦杏仁苷的最佳条件。在此基础上,对苦杏仁苷差向异构体混合物进行了分离提纯,制备得到纯度为99.7%的l-苦杏仁苷对照品,其结构经过质谱和核磁共振谱的确证。体外酶解实验发现,d-和l-苦杏仁苷酶解产毒过程中存在明显差异。在相同条件下,d型苦杏仁苷的酶解速率常数是l型的7.7倍。由于苦杏仁苷在体内同样是经酶解生成氢氰酸发挥药效,所以酶解速率的不同将导致氢氰酸暴露剂量的差异,可能导致d-和l-苦杏仁苷在药效与毒性等方面存在差异,d-苦杏仁苷酶解速率更快,可能在发挥药效上起着更大的作用。第三章,基于建立的高效液相色谱方法(hplc)对氰苷类中成药中苦杏仁苷的含量进行测定,重点关注不同来源和剂型的中成药中d-和l-苦杏仁苷的含量及其转化。首先,建立了灵敏准确的测量中成药中d-和l-苦杏仁苷含量的hplc方法,并开展了相关的方法学研究。结果表明,d-和l-苦杏仁苷在2~500mg/l范围内线性关系良好,r2为0.999,检测限为0.8mg/l,定量限为2mg/l,精密度、回收率、稳定性和重复性均符合要求,说明该方法稳定可靠。然后,以含有苦杏仁的中成药为代表,通过该方法对17种42个批次的中成药中的d-和l-苦杏仁苷含量以及异构化比例进行了测定,实验结果显示d-苦杏仁苷含量范围是0.018%~1.158%,l-苦杏仁苷含量范围是0.003%~0.434%,异构化比例范围是8.03%~53.35%。基于异构化比例的差异可能导致不同的药理活性及毒性等问题,本课题针对通宣理肺方剂开展相关研究,通过比较不同剂型的通宣理肺方剂以及不同来源的通宣理肺丸中d-和l-苦杏仁苷的含量和异构化比例,发现中成药的剂型、工艺和来源等因素均可能对苦杏仁苷的差向异构化比例产生影响。研究表明剂型因素是d-苦杏仁苷向l-苦杏仁苷转化的重要因素,剂型工艺越复杂,生成的l-苦杏仁苷的含量越高。该结果可为相关中成药产品的工艺优化提供借鉴,且所得含量及异构化比例等研究结果可为氰苷类中成药中苦杏仁苷的安全限量标准制定提供依据。最后,基于多级质谱技术,针对不同种类氰苷,开展了质谱裂解规律的研究,研究表明氰苷化合物中糖基与氰醇间c—o键容易断裂,形成多糖或单糖的特征峰。总结已有氰苷的质谱裂解规律,对于氰苷筛选以及未知氰苷的结构鉴别具有借鉴意义,为实现氰苷物质快速筛选策略提供试验依据。第四章,立足复杂基质,建立了表面增强拉曼光谱(sers)和气相色谱(gc)两种方法,快速检测中成药提取液中氢氰酸的含量。鉴于氰苷化合物在中成药加工或口服过程中有可能发生自身酶解而产生氢氰酸,本课题致力发展针对中成药中氰化物的简单灵敏的检测方法。sers技术具有快速、灵敏、便携等特点,在现场检测中具有极大的优势,但是在复杂基质中,会受到其他物质的严重干扰。因此本课题通过设计在线净化富集装置,解决了复杂基质中测量CN-的难题。通过在线净化富集装置检测不同浓度氰化物对照品,检测限为0.05 mg/L,在浓度范围0.1~2 mg/L内线性良好,R2为0.997,由于拉曼散射强度容易受光学系统参数等因素的影响,且线性范围较窄,为了验证该SERS方法的有效性和可靠性,所以本课题进一步发展了定量更为准确的GC方法检测中成药中氰化物含量,并对其进行了方法学考察,结果表明该方法在范围0.05~50 mg/L内的线性良好,R2为0.996,定量限为0.05 mg/L,检测限为0.025 mg/L。运用这两种方法,对不同的氰苷类中成药进行测量,结果表明仅在个别中成药中检出氰化物,表面增强拉曼光谱和气相色谱的检测结果基本一致。通过气相色谱方法的分析结果所得,中成药中HCN含量最高26.60 mg/L,未达到人体中毒剂量,但由于中成药一般为长期服用,所以长期低剂量毒性效应不可忽视。另外,发现测得氰化物的中成药均为丸剂,可能由于丸剂加工工艺简单,制备过程中酶没有完全失活,所以中成药中苦杏仁苷的限量,需要对D-和L-苦杏仁苷的活性差异,炮制过程中苦杏仁苷的转化,中成药剂型工艺等因素综合考虑,合理的进行制定。