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张迷(2009)等人在已构建的蜡梅花cDNA文库及EST分析的基础上得到了2个蜡梅水通道蛋白基因CpAQP1和CpAQP2。通过构建植物表达载体,利用根癌农杆菌介导的叶盘法转化烟草,对转基因烟草进行干旱、高盐、高温处理,发现转基因烟草的耐受性比非转基因烟草有显著提高,初步证明蜡梅水通道蛋白与植物抗逆性有关。为了进一步验证和探索该基因的功能,可以通过研究该基因转录水平变化和分析启动子调控区域说明CpAQP1在抗逆性及其他生理功能中可能起到的作用。因此,本研究在张迷等人的基础上,利用荧光定量PCR技术对蜡梅花发育的各个花期、各个组织和不同胁迫下的水通道蛋白CpAQP1的表达量进行分析,并利用hi-TAILPCR技术克隆蜡梅水通道蛋白基因CpAQP1基因启动子区域1082bp,利用生物信息学软件对其进行分析,并构建植物表达载体,通过根癌农杆菌介导的叶盘法转化模式植物烟草,研究该启动子活性。本文主要研究结果如下:
1、CpAQP1基因的表达分析
实时荧光定量PCR分析表明:CpAQP1在蜡梅不同组织中的表达量不同,盛开期花瓣中的表达量最高,该基因的表达可能具有发育阶段特异性;在高温、低温、高盐、ABAA和重金属不同非生物胁迫处理下,CPAQP1的表达量变化趋势也存在差异.结果说明CPAQP1可能在蜡梅的生长发育、细胞衰老和非生物胁迫应答的过程中发挥作用.
2、CpQP1启动子的克隆
在CpQP1基因ORF的5端设计三条巢式引物,利用Liu等人改良的TAIL-PCR:hiTAIL-PCR法扩增到蜡梅水通道蛋白基因CpQP1的5启动子1082bp,命名为CpQP1pro(GenBank登录号:JQ952563)。
3、CpAQP1pro启动子序列分析
用PlantCare软件对CpAQP1pro进行分析,该启动子除了具有TATA-box和CAAT-box等基本转录元件外,还有光应答元件、茉莉酸甲酯应答顺式调控元件、水杨酸应答元件、胁迫相关应答元件、胚乳表达必须的顺式作用元件。
4、植物表达载体构建
通过酶切和连接将该启动子代替植物表达载体PBI121中的35s启动子与GUS报告基因相连,通过PCR和双酶切验证结果,说明已成功构建植物表达载体PBI121-CpAQP1pro。
5、烟草转化及活性分析
利用根癌农杆菌介导的叶盘法将转入表达载体的PBI121-CPAQP1pro转入野生型烟草,通过对转基因烟草叶片GUS组织化学染色,结果说明该启动子具有活性,可驱动下游报告基因表达。