大豆耐低钾胁迫相关基因的筛选与功能验证

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钾是植物体内含量最丰富的无机阳离子,是影响植物生长发育和新陈代谢最重要的元素之一,其以可溶性无机盐或离子形式广泛分布于植株的各个组织中。钾在土壤中主要以速效钾形态被植物吸收和利用,在自然界和农业生产中,植物经常会遭受低钾胁迫,植物为了适应钾的缺乏,保持植株体内钾离子的平衡,在长期的进化过程中形成了许多的适应机制。植物从外界环境吸收和转运有效钾主要通过植株根系细胞膜上多种不同亲和力的钾转运和通道蛋白表达来完成,同时会受到一些转录因子的调节。在模式植物拟南芥中,有关钾离子通道和转运蛋白已得到深入研究。钾素是大豆不可或缺的营养元素,但关于大豆植株的钾素吸收、转运相关的功能基因及其表达调控机制却知之甚少。为了明确大豆在低钾胁迫条件下钾转运和通道蛋白及相关基因的功能,本研究从耐低钾胁迫和不耐低钾胁迫2个大豆材料的数字表达谱了解并筛选与钾胁迫响应相关的差异表达的基因,利用Real-Time PCR验证所选基因的表达差异,通过生物信息学方法分析该基因的功能,对获得的相关基因采用绿色荧光蛋白融合蛋白进行亚细胞定位,并在不同培养条件取样测定过表达植株和野生型不同部位的钾含量;旨在通过转化拟南芥对候选基因的功能进行初步的验证,为大豆转基因育种提供理论基础。研究获得了以下主要结果:1.在低钾条件下,观察2种极端耐性大豆材料对低钾胁迫的反应,根据表型性状、根系相关指标验证了钾高效材料油06-71和钾敏感材料衡春04-11。2.以钾高效和钾敏感型大豆材料为试验材料,设置低钾胁迫试验,在8个时间段取样提取RNA,利用Real time-PCR检测GmKT12基因的表达量,结果显示GmKT12基因在不同材料地上部和地下部表达水平有显著差异,其原因为GmKT12基因的氨基酸序列和蛋白质结构发生变异。从2个材料中分别克隆目的基因并对基因序列进行同源性及生物信息学分析,结果表明,与GmKT12基因相似性在30%以上的同源基因有56个,GmKT12在进化树中的位置与Glyma18g18822最近;GmKT12编码蛋白为可溶性跨膜蛋白,具有多个磷酸化位点,表明该基因与信号转导有关,对大豆获取钾离子及转运可能起着关键作用。3.以钾高效和钾敏感型大豆材料为试验材料,设置低钾胁迫试验,在8个时间段取样提取RNA,利用Real time-PCR检测GmKAB1基因的表达量,结果显示GmKAB1基因在地下部相对表达水平比地上部持续时间更长,地下部相对表达倍数最高为3.5,较地上部相对表达倍数更高。克隆目的基因并对基因序列进行同源性及生物信息学分析,结果表明,与GmKAB1基因相似性在30%以上的同源基因有45个,GmKAB1在进化树中的位置与Glyma20g19000最近;GmKAB1编码蛋白为稳定的可溶性蛋白,具有2个保守结构域和多个磷酸化位点,表明在受到低钾胁迫后该基因编码的β亚基与α亚基结合调控电压门控钾离子通道,对大豆从根部获取钾离子可能起着关键作用。4.以钾高效和钾敏感型大豆材料为试验材料,设置低钾胁迫试验,在8个时间段取样提取RNA,利用Real time-PCR检测GmWRKY50基因的表达量,结果显示GmWRKY50基因在地下部相对表达差异较大,地上部也存在差异,地上部与地下部差异趋势一致。克隆目的基因并转化洋葱表皮细胞及拟南芥,结果表明,GmWRKY50基因在洋葱表皮细胞核中表达,与该基因行使的转录因子功能一致,筛选转化阳性植株至T3代后观察过表达植株与WT表型,表明该基因在植株处于低钾胁迫时过表达植株根系和叶片长势均好于WT,对不同过表达株系和野生型拟南芥进行钾含量的测定,结果显示正常条件下没有显著差异,但在低钾条件下,该基因过表达植株钾含量显著高于野生型,说明该基因在植株受到胁迫时会高表达,调控下游基因,进而促进植株对营养的竞争。
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