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研究背景：膀胱癌是泌尿系最常见的恶性肿瘤之一，也是一个重要的公共卫生问题，世界上每年诊断的膀胱癌超过200000例，每年约有12000人死于膀胱癌。在美国，位于最常见的恶性肿瘤中的第4位，在我国，发病率位于泌尿生殖系统肿瘤的第一位。膀胱癌90％以上为移行上皮细胞癌，15％左右的膀胱癌患者初诊时即存在局部或远处转移病灶，20％～30％表浅性膀胱癌术后将发展为浸润性或转移性癌，根治性膀胱切除术后30％～40％的浸润性膀胱癌出现远处转移，远期疗效不佳。特别是表浅性膀胱癌经尿道切除后的高复发率已经成为了治疗中亟待解决的问题。随着自杀基因（suicide gene）系统对膀胱癌治疗研究的逐步深入，大家逐渐认识到自杀基因系统是一种发展前景良好的治疗方法，但是也存在着如基因转染效率低下，基因转导的靶向性差，各类载体及自杀基因本身对机体的毒性和损伤作用，载体及肿瘤细胞杀死后引发的自身免疫反应，前体药物代谢产物仅仅针对分裂期细胞等局限性。为了弥补自杀基因治疗系统的不足，越来越多的学者都在致力于研究将现有的治疗方法和自杀基因治疗系统相结合，以寻找对抗膀胱癌复发的新思路和新途径。羟基喜树碱（HCPT）、吡柔比星（THP）是目前临床预防膀胱癌复发的膀胱灌注化疗药物。HCPT是从珙桐科植物喜树（Camptothecaacuminata Decne）中提取得到的一种微量生物碱，抗瘤谱广，能够选择性地抑制拓朴异构酶而干扰DNA的复制，和其他抗肿瘤药物无交叉耐药，有良好的协同作用。利用HCPT这一特有的性质，结合TK基因联合治疗膀胱癌的方法目前尚无相关报道。THP是新一代半合成蒽环类抗肿瘤药物，是在阿酶素的氨基糖4’端加了一个吡喃环，使它抗肿瘤的活性、靶细胞的药物浓度明显提高，半衰期缩短，毒副作用明显减少。它进入细胞核，嵌入DNA的双螺旋链，抑制DNA聚合酶A和B，阻止了核酸的合成，使肿瘤细胞不能进行细胞分裂而导致肿瘤细胞死亡。本实验采用HSV-TK系统联合小剂量化疗药物（HCPT、THP）对人膀胱癌T—24进行治疗，并对其体外杀伤作用进行比较，为自杀基因联合化疗药物治疗膀胱癌提供一定的实验依据。目的：1、研究腺病毒介导的HSV-TK系统联合小剂量羟基喜树碱（HCPT）对人膀胱癌细胞的体外杀伤作用。2、研究腺病毒介导的HSV-TK系统联合小剂量吡柔比星（THP）对人膀胱癌细胞的体外杀伤作用。方法：1、体外培养T—24细胞；2、使用含有单纯疱疹病毒胸苷激酶（herpes simplex virus-thymidine kinase，HSV-TK）基因和绿色荧光蛋白（green fluorscent protein，GFP）基因的复制缺陷腺病毒（AdCMV-TK，Adv）转染293细胞，扩增腺病毒；用绿色荧光蛋白表达细胞计数测定腺病毒滴度。3、腺病毒感染人膀胱癌细胞T—24，获取转染TK基因的T—24细胞。分别提取人膀胱癌细胞T—24以及转染TK基因T—24细胞RNA，进行RT-PCR反应，电泳鉴定。4、在体外培养T—24的细胞培养液中，加入HCPT，HCPT浓度为0、0.001、0.01、0.1、1、10、50、100、200mg／L，采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法测定单纯HCPT作用人膀胱癌细胞72h细胞增殖抑制率，确定HCPT的有效作用浓度。5、在体外培养T—24的细胞培养液中，加入THP，THP浓度为0、0.1、1、10、100mg／L，同样采用MTT法测定单纯THP作用人膀胱癌细胞72h细胞增殖抑制率，确定THP的有效作用浓度。6、根据HCPT的有效作用浓度，选择对T—24细胞杀伤作用较小的浓度梯度（0.01、0.05、0.1、0.5、1mg／L）。同时根据以前的试验结果，确定使用对T—24细胞杀伤作用较小GCV浓度（0.25mg／ml）。以正常T—24细胞为空白对照，采用MTT法测定各组治疗转染后人膀胱细胞24h、48h、72h细胞存活率。7、根据THP的有效作用浓度，选择对T—24细胞杀伤作用较小的浓度梯度（1、5、10、15、20mg／L）。联合GCV（0.25mg／ml）对转染后人膀胱细胞进行治疗。以正常T—24细胞为空白对照，采用MTT法测定各组治疗24h、48h、72h细胞存活率。结果：1、293细胞能大量扩增腺病毒，纯化后腺病毒滴度为1.58×1010PFU／ml。2、经RT-PCR扩增转染腺病毒的T—24细胞出现大小为234bp的TK基因片段，而未转染腺病毒的T—24细胞未扩增出相应片段，表明感染腺病毒的T—24细胞有TK基因mRNA表达。3、随着浓度的增高，HCPT对T—24细胞的生长抑制率逐渐增高，HCPT浓度为0.01 mg／L时T—24生长抑制率为13.63％，50 mg／L时T—24生长抑制率为64.44％，当HCPT浓度大于100 mg／L时，抑制作用无明显增加（P=0.117）。表明HCPT可以良好的抑制人膀胱癌细胞的生长，同时有浓度依赖性。4、THP浓度小于1 mg／L，对T—24生长抑制率小于30％，大于1 mg／L至100 mg／L，抑制曲线明显变陡，浓度为50 mg／L时，抑制率为62.94％，浓度为100 mg／L时，抑制率到达93.22％。随着THP浓度的增加，对T—24细胞的抑制作用也明显增强（P=0.00）。5、GCV+HCPT各组和单独使用GCV组相比，对转染后细胞有明显杀伤作用有明显的增强（P=0.00），GCV+HCPT组随HCPT浓度增高和作用时间的延长，杀伤效率明显增高。0.25mg／ml GCV单独作用于转染后的膀胱癌细胞72h后，细胞存活率为54.40％，GCV（0.25mg／ml）+HCPT（1mg／L）组的细胞存活率仅为33.57％（P=0.00）。提示HSV-TK／GCV系统联合小剂量HCPT能够增强对人膀胱癌细胞T—24的杀伤作用，且优于单一使用HSV-TK／GCV系统。6、GCV+THP各组对转染后膀胱癌细胞作用72小时后也均较GCV组有显著的增强（P=0.00），各组之间的杀伤效率随着浓度梯度的增加也有明显增高（P=0.00）。表明HSV-TK／GCV自杀系统联合小剂量THP治疗时，也能增强治疗组的杀伤作用，并表现出和GCV+HCPT组相同的浓度、时间相关性。结论：1、腺病毒载体能有效的将HSV-TK基因导入人膀胱癌细胞中表达；2、羟基喜树碱可以在体外对人膀胱癌T—24细胞进行有效的杀伤；3、吡柔比星可以在体外对人膀胱癌T—24细胞进行有效的杀伤；4、HSV-TK／GCV系统联合小剂量化疗药物羟基喜树碱能增强自杀基因系统对人膀胱癌细胞的体外杀伤作用；5、HSV-TK／GCV系统联合小剂量化疗药物吡柔比星治疗能增强自杀基因系统对人膀胱癌细胞的体外杀伤作用。