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研究目的研究肾胺酶对脂肪肝IRI的保护作用及其机制。初步揭示脂肪肝对IRI更加易感的原因,为脂肪肝IRI的防治提供重要的理论依据。研究方法动物实验方面:采用高脂饲料(high fat diet,HFD)喂养C57BL/6小鼠20周,构建NAFLD动物模型。同时设立正常饮食(control diet,CD)组作为对照。将HFD小鼠与CD小鼠分为假手术组(Sham组)、IR组、肾胺酶预处理组(IR+RNLS组)。IR组进行70%肝脏血流阻断及复流术,构建肝脏IRI模型;Sham组只进行单纯的开关腹操作;IR+RNLS组在肝脏血流阻断前15min以及再灌注后15min分别予以尾静脉注射0.5mg/kg重组人RNLS蛋白。实验完毕后收集小鼠血清进行肝功能指标检测(ALT、AST、LDH);收集肝脏组织进行HE染色,观察肝脏组织损伤情况;采用免疫组化(immunohistochemistry,IHC)、蛋白印记(western blot,WB)、PCR、ELISA等方法检测肾胺酶的表达。采用MDA、SOD、GSH试剂盒检测组织氧化应激水平及抗氧化能力。细胞实验方面:采用含油酸(Oleic acid,OA)的培养基培养Hep G2细胞24h,构建脂肪化肝细胞模型。同时设立正常培养的阴性对照组。采用叔丁基过氧化氢(tert-butyl hydroperoxide,t-BHP)处理3h,构建氧化应激模型,模拟肝脏IR过程中出现的ROS爆发。与动物实验类似,我们将脂肪化肝细胞(OA)与非脂肪化肝细胞(control,Ctrl)分为空白对照组(negative control,NC组),氧化应激组(t-BHP组)、RNLS预处理组(RNLS+t-BHP组)。待细胞处理完毕之后,通过WB、PCR与免疫荧光(immunofluorescence,IF)检测细胞RNLS水平;通过MTT检测细胞活力;WB检测Bcl-2、Bax、cyto C的表达,判断细胞凋亡情况;采用DCFH-DA探针检测细胞内ROS含量,采用JC-1试剂盒检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,△Ψ)的变化,采用IF检测TOM20标记的线粒体形态、WB检测线粒动态相关蛋白Drp1、MFF、MFN1、OPA1判断线粒体形态及动态变化。并进一步通过NAD+、Ex527(SIRT1抑制剂)处理细胞,WB检测SIRT1的表达与活性,研究SIRT1在其中发挥的作用。最后,我们通过生物信息学分析以及组织、细胞样本检测,筛选RNLS上游调控因子,研究其在脂肪肝中表达下降的机制。结果1.RNLS减轻脂肪肝小鼠IRI脂肪肝中RNLS水平明显低于非脂肪肝。HFD小鼠在肝脏IR处理后,肝脏坏死面积、肝酶ALT、AST、LDH水平明显高于CD小鼠,提示脂肪肝更易发生IRI。此外,RNLS预处理能够明显缩小IR所致的肝脏坏死面积、降低肝酶ALT、AST、LDH的水平,提示RNLS能够减轻脂肪肝IRI。2.RNLS减轻脂肪化肝细胞氧化应激损伤OA诱导的脂肪化肝细胞(OA)中RNLS水平较非脂肪化肝细胞(Ctrl)明显降低。氧化应激处理后,脂肪化肝细胞的细胞活力明显低于非脂肪化肝细胞,RNLS预处理能明显减轻氧化应激所致的细胞损伤。采用si-RNLS敲低细胞RNLS表达后,其氧化应激损伤较非敲低细胞(si-NC)明显加重。综上表明,RNLS可以减轻肝脏IRI,提示RNLS的降低可能是NAFLD更易受IRI的原因。3.RNLS增加组织与细胞的抗氧化能力肝脏IR后,肝脏组织中脂质过氧化产物丙二醛(malonaldehyde,MDA)明显上升,抗氧化酶SOD活性、GSH水平则显著降低。RNLS预处理能明显降低MDA含量,提高SOD活性、GSH水平,减轻氧化应激水平。IR处理后,HFD小鼠肝脏组织中MDA较CD小鼠上升更为明显,GSH、SOD下降更为明显。与此类似,细胞在t-BHP处理后,脂肪化肝细胞内的ROS水平明显高于非脂肪化肝细胞。RNLS预处理能明显降低t-BHP所致的ROS爆发,减轻氧化应激水平。4.RNLS减轻氧化应激所致的线粒体功能障碍细胞在t-BHP处理后,细胞线粒体膜电位明显降低,细胞线粒体分裂水平明显增加,其中脂肪化肝细胞改变较非脂肪化肝细胞更加明显。在t-BHP处理后,脂肪化肝细胞的线粒体形态呈现出更加明显的碎片状,线粒体分裂相关蛋白Drp1、MFF表达较非脂肪化肝细胞升高更加明显,反之线粒体融合相关蛋白MFN1、OPA1表达降低更加显著。作为线粒体损伤结果,t-BHP处理后,Bax、cyto C表达增加,Bcl-2水平降低,凋亡水平升高。脂肪化肝细胞凋亡水平升高更加显著。RNLS预处理能够明显提高线粒体膜电位,恢复线粒体形态,改善线粒体功能,抑制细胞凋亡。5.RNLS激活SIRT1,减轻细胞氧化应激损伤脂肪肝以及脂肪化肝细胞中,SIRT1的表达明显降低、ac-p53的水平明显升高。提示SIRT1的表达与活性均明显降低。敲低RNLS后,SIRT1的表达与活性明显下降,外源性补充RNLS后,SIRT1的表达与活性明显升高。提示RNLS可以激活SIRT1。NAD+预处理能明显降低细胞氧化应激损伤,同时予以Ex527处理能够明显削弱NAD+的保护作用。提示RNLS通过增加NAD+含量激活SIRT1,发挥肝脏IRI的保护作用。6.STAT3转录调控RNLS的表达生物信息学分析发现,NAFLD中STAT3表达降低。同样,脂肪肝与脂肪化肝细胞中STAT3的基因与蛋白水平均明显降低。提示在HFD情况下RNLS的表达降低可能是由于STAT3水平降低所致。结论1.RNLS在脂肪肝与脂肪化肝细胞中表达降低。2.RNLS可以减轻脂肪肝IRI,也可以减轻脂肪化肝细胞的氧化应激损伤。3.RNLS可以抑制IR所诱发的ROS爆发、提高细胞抗氧化能力,最终减轻氧化应激水平。4.RNLS可以通过抑制线粒体分裂从而维持线粒体稳态,抑制凋亡。5.RNLS通过增加NAD+含量,激活SIRT1,减轻肝脏IRI。6.脂肪肝与脂肪化肝细胞中STAT3表达降低、转录调控功能下降,导致RNLS表达降低。7.脂肪肝更易受IRI与RNLS表达降低、保护作用不足有关。