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猴B病毒(SimianB virus,BV)是一种引起人畜共患病的双链DNA病毒,猕猴为其自然宿主。猴在感染B病毒后,通常不表现明显的临床症状,有时表现出口腔的疱疹样损伤如口腔溃疡、结膜炎或牙龈炎,随后转变成慢性感染。B病毒主要通过唾液或生殖道分泌物经被感染猴所咬伤及抓伤传染给人类,造成的死亡率超过70%,且病患多表现为脑炎、脑脊髓炎等严重症状,且目前无特效的抗病毒治疗法。BV能够引起人和非猕猴灵长类的高致死率,给实验动物研究人员带来巨大的潜在危害。在猴B病毒编码的各种蛋白质中,gD蛋白具有种群和型特异性,是保守的结构蛋白,在病毒的进化中变异率比较低,携带有群特异性抗原决定簇,能刺激被感染机体产生强的群特异性免疫反应,对于易发生变异的猴B病毒的血清学诊断具有重要的应用价值。本研究在对猴B病毒gD基因进行分析和密码子优化的基础上,进行基因的人工合成和gD蛋白的原核表达,并制备其相应的单克隆抗体,为建立一种快速、有效的检测BV的诊断试剂研制奠定基础。主要研究内容和结果如下:1.猴B病毒gD蛋白的原核表达及纯化产物鉴定参照已公布的猴B病毒E2490毒株全序列,分析其中编码gD蛋白的基因序列,根据大肠杆菌的密码子偏爱性进行密码子优化,并由苏州金唯智生物科技有限公司进行DNA合成。合成的基因片段选用pET-32a原核表达载体进行表达。将gD基因片段克隆于pET-32a表达载体中、经抗性筛选、PCR扩增、限制性内切酶分析、测序分析,筛选获得BV-gD基因片段正向插入、有正确读码框的阳性克隆。阳性克隆质粒在E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞中经IPTG诱导表达,筛选到重组载体pET-32a/gD。镍琼脂糖凝胶亲和层析柱分离重组载体pET-32a/gD表达的带His标签的重组gD蛋白。SDS-PAGE、Western blotting实验表明,表达蛋白为融合蛋白,分子量约为53kDa,这些重组蛋白得到正确表达。2.猴B病毒gD蛋白的单克隆抗体制备及鉴定本研究通过原核表达的猴B病毒囊膜蛋白(gD)为免疫原,纯化后经皮下免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合。以重组gD蛋白作为检测原进行包被,用间接ELISA筛选抗gD阳性细胞株,采用有限稀释法对其进行亚克隆,经过3次亚克隆,共获得5株能稳定分泌抗BV gD蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为4E3、3E7、3F8、1H3和4B6,其细胞培养上清ELISA效价均为1:640,腹水ELISA效价分别为1:2X 106、1:2×105、1:2×105、1:2×103和 1:2×102。亚类鉴定结果显示,单抗 1H3 和 4E3 为IgG2b亚型,单抗3E7、3F8和4B6为IgG1亚型,轻链均为K链。SDS-PAGE分析表明,五株单抗纯化后均能有两条明显的条带。间接免疫荧光实验结果表明,5株单抗均能很好的识别HSV-2感染Vero细胞中的gD同源蛋白,Western-blotting实验结果显示,3E7、3F8及4E3均能很好的识别HSV-2感染Vero细胞中的gD同源蛋白,而4B6和1H3则不能很好的识别。说明单抗3E7、3F8以及4E3株识别的gD蛋白抗原表位为HSV-2和BV之间相对较为保守的线性表位,而4B6和1H3可能仅别gD蛋白中的构象型表位,或识别的表位为BV gD蛋白中不同于HSV-2的区段,对BV病毒有较强的特异性。本研究制备了大量的重组BV-gD蛋白抗原,并通过ELISA实验验证了,其与感染BV的猴血清有特异性反应,总符合率为75%,这为猴B病毒检测试剂盒的研制奠定了基础。制备的单克隆抗体为进一步研究gD囊膜蛋白功能、建立BV检测方法以及HSV-2的基础研究均可提供一种有力的工具。